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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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基于分子对接研究小分子对冰核蛋白的微观抑制机理

    作者简介: 胡响响(1996—),男,河南睢县人,硕士生,主要研究方向为高分子物理。E-mail:xxhu@ciac.ac.cn;
    通讯作者: 张然, rzhangciac@ciac.ac.cn ; 石彤非, rzhangciac@ciac.ac.cn
  • 中图分类号: O641

Microscopic Inhibition Mechanism of Small Molecules on Ice Nucleation Protein Based on Molecular Docking

    Corresponding author: ZHANG Ran, rzhangciac@ciac.ac.cn ;SHI Tongfei, rzhangciac@ciac.ac.cn ;
  • CLC number: O641

  • 摘要: 自然界广泛存在着的冰核蛋白(INP)能够在微观尺度诱导水分子规整排列,提高冰点,而其蛋白三级结构仍未能通过实验确定。最新研究表明冰核蛋白具有与抗冻蛋白(AFP)结构相同的冰结合模板TXT,但INP模板面积更大导致其功能与AFP完全相反。相关研究表明INP可通过酪氨酸(TYR)阶梯结构二聚化形成新的β-螺旋二聚体进而增加结冰活性表面积来促进冰核的形成。同时在一系列对照实验中,发现聚甘油能够结合并抑制冰核细菌丁香假单胞菌INP的冰成核活性。因此,本文通过使用分子模拟软件AutoDock研究甘油和三聚甘油分子与北方假单胞菌的冰核蛋白模型之间的相互作用,以期阐释该抑制行为的分子机理以及是否在冰核蛋白类结构中具有普适性。结合信息显示了配体分子与TXT结冰模板和TYR阶梯结构之间的不同结合能力,并且在与TXT结冰模板的结合中发现有冰核蛋白其他残基参与结合。模拟结果表明配体分子与INP的特异性结合可能适用于其他具有类似结构的INP。该结果为聚甘油作为冷冻保护材料的开发和进一步理解冰核蛋白结冰机理提供了有用的理论信息。
  • 图 1  PbINP的三维模型

    Figure 1.  Three-dimension model of PbINP

    图 2  冰核蛋白模拟过程中产生的结构相对于初始结构的均方根偏差(RMSD),以及模拟结束时INP单体和二元体的空间结构视图(其中图(c)和(e)是图(b)和(d)中结构的俯视图)

    Figure 2.  Root mean square deviation (RMSD) of the structure produced during the simulation of ice nucleation protein with respect to the initial structure, and the views of the spatial structure of INP monomer and binary body at the end of simulation (in which Fig. (c) and (e) are the top views of the structures in Fig. (b) and (d)).

    图 3  配体分子与PbINP的结合模式

    Figure 3.  Binding modes of ligand molecule and PbINP

    表 1  配体分子与酪氨酸残基对接结果

    Table 1.  Result of ligand molecule docking TYR residues

    LigandResidue
    site
    Binding energy/
    (kcal·mol−1)
    ki/
    (μmol·L−1)
    Number of
    same clusters
    Glycerol18, 34, 50−3.81630157
    −4.87267.1523
    50, 66, 82−3.5272097
    −4.76323.2240
    98, 114, 130−4.13946.8583
    −4.81295.7152
    Triglycerol18, 34,5 0,
    66, 82
    −3.721870234
    66, 82, 98,
    114, 130
    −4.63404.52162
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    表 2  配体分子与苏氨酸残基对接结果

    Table 2.  Result of ligand molecule docking THR residues

    LigandResidue
    site
    Binding energy/
    (kcal·mol−1)
    ki/
    (μmol·L−1)
    Number of
    same clusters
    Glycerol5,7,21,23,37, 39−5.4798.41122
    −6.898.9372
    53,55,69,71,
    85 ,87
    −6.1829.32152
    101,103,117,
    119,133,135
    −6.4119.92186
    Triglycerol5,21,37,53−5.5782.22155
    7,23,39,55−3.821580187
    −5.37115.98108
    37,53,69,85−5.25142.24233
    39,55,71,87−4.8303.56292
    85,101,117,133−5.0217.51139
    87,103,119,135−6.839.78249
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-12-18
  • 网络出版日期:  2021-02-07

基于分子对接研究小分子对冰核蛋白的微观抑制机理

    作者简介:胡响响(1996—),男,河南睢县人,硕士生,主要研究方向为高分子物理。E-mail:xxhu@ciac.ac.cn
    通讯作者: 张然, rzhangciac@ciac.ac.cn
    通讯作者: 石彤非, rzhangciac@ciac.ac.cn
  • 1. 伊犁师范大学物理科学与技术学院,新疆凝聚态相变与微结构实验室,新疆 伊宁 835000
  • 2. 中科院长春应用化学研究所,高分子物理与化学国家重点实验室,长春 130022
  • 3. 中国科学技术大学,应用化学与工程学院,合肥 230026

摘要: 自然界广泛存在着的冰核蛋白(INP)能够在微观尺度诱导水分子规整排列,提高冰点,而其蛋白三级结构仍未能通过实验确定。最新研究表明冰核蛋白具有与抗冻蛋白(AFP)结构相同的冰结合模板TXT,但INP模板面积更大导致其功能与AFP完全相反。相关研究表明INP可通过酪氨酸(TYR)阶梯结构二聚化形成新的β-螺旋二聚体进而增加结冰活性表面积来促进冰核的形成。同时在一系列对照实验中,发现聚甘油能够结合并抑制冰核细菌丁香假单胞菌INP的冰成核活性。因此,本文通过使用分子模拟软件AutoDock研究甘油和三聚甘油分子与北方假单胞菌的冰核蛋白模型之间的相互作用,以期阐释该抑制行为的分子机理以及是否在冰核蛋白类结构中具有普适性。结合信息显示了配体分子与TXT结冰模板和TYR阶梯结构之间的不同结合能力,并且在与TXT结冰模板的结合中发现有冰核蛋白其他残基参与结合。模拟结果表明配体分子与INP的特异性结合可能适用于其他具有类似结构的INP。该结果为聚甘油作为冷冻保护材料的开发和进一步理解冰核蛋白结冰机理提供了有用的理论信息。

English Abstract

  • 在严酷的自然环境中,一些耐冻植物、细菌和微生物通过自身调节机制实现胞外结冰从而有效保护细胞和组织免受低温破坏,适应在零度以下生存。这些生物自身能够生成一种冰核活性物质,人们称其为冰核蛋白(Ice nucleation proteins, INPs)。这些生物INP首先在细菌和昆虫中被发现,后来在极地鱼类和两栖类生物中也有被报道。如上世纪70年代人们发现造成植物霜冻伤害的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)等菌类细胞表面存在一种高冰核活性(−5.0 ~ −2.5℃)的INP[1]。目前有关冰核细菌的研究对象主要是丁香假单胞菌一类的冰核活性细菌[2, 3]。冰核可由无机物、有机物等非生物产生,也可通过生物形成,其中生物冰核是自然界具有冰核活性最强的异质冰核。冰核细菌作为一种生物冰核,之所以能够在较高温度形成冰晶,是因为细菌表面的INP能够诱导环境水分子规整排列,实现冰点升高。冰核细菌通过INP可以显著降低植物中水的过冷点,造成植物霜冻;近年来人们将INP的结冰机理应用于促冻杀虫、人工降雪等领域,收效显著[4-7]

    INP由于分子量很大(105)以上,难以通过结晶分析获得其蛋白结构。早期研究已证实不同冰核细菌的INP具有相似的基因序列,其一级结构通常由三个部分组成[8-10]:1个N−末端结构域,序列占比15%,主要功能是将INPs锚定细胞膜表面,一旦缺失会造成冰核活性显著下降;一个高度亲水的C−末端,其序列占比4%,主要功能与形成INP多聚体有关;中间序列部分为高度重复的48肽区域,序列占比约为81%,主要负责诱导水分子结冰,部分缺失后会导致冰核活性降低但不会完全消失。关于INP的二级结构,人们认为两端(N−末端和C−末端)是由包括α−螺旋和β−链形成的球状区域,而中间段是由柔性卷曲和β−链交替形成[11]。INP的蛋白结构解析难点在于三级结构,目前还没有确定的实验结果。2001年 Graether和Jia[12]基于昆虫INP结构特点对中心重复区域进行螺旋折叠建模并成功提出了一种新的冰核蛋白模型,认为INP中心重复区的TXT结冰模板(T为苏氨酸,X为其他残基)与抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)的TXT模板基元构成形式相同,借此实现与水分子的相互作用,并通过理论推断认为具有冰核活性的TXT部分的表面积存在一个临界值,INP的冰晶模板的表面积远大于该值从而促进了冰核的形成。Garnham等[13]通过对北方假单胞菌的INP模型建模,提出北方假单胞菌(Pseudomonas borealis)的INP利用内部的丝氨酸和谷氨酰胺阶梯进行稳定化,并通过酪氨酸阶梯沿着二聚化界面形成新的β−螺旋二聚体,二聚化显著增加了蛋白质的“冰活性”表面积。该模型在所有已知的细菌INP基因序列和蛋白结构预测中具有高度普适性,因此作者预测它的折叠和作用机制将适用于其他冰核蛋白。由于没有真正从实验中获取INP的结晶结构,人们对INP的诱导结冰机理的理解还有待进一步的研究。

    在研究INP结构和结冰机理的探索过程中,人们在各种植物和动物中发现了针对INP的抑制剂,这些抑制剂能够通过降低过冷点的方式减少细胞内或细胞外结冰现象,从而避免植物霜冻和细胞冷冻[14-19]。其中Wowk和Fahy[20]通过实验发现分子量为750道尔顿的聚甘油能够结合并抑制冰核细菌丁香假单胞菌蛋白的冰核活性,通过对照实验认为聚甘油似乎对细菌冰成核蛋白具有特异性,但目前尚无对此内在机理的深度探讨。聚甘油是无色黏稠状的液体或半固体,含有侧羟基和醚建,可溶于水及乙醇,是一种多元醇。同时聚甘油具有较小的挥发性、吸湿性和对人和动物的无害性,是一种十分重要的生物质平台分子,可以通过多种途径转化成一系列高附加值的工艺产品[21-24],因而聚甘油有望在作物保护和组织冷冻保存等工作中得到应用。因此,本次工作对聚甘油分子与INP中间重复区域的相互作用方式和机理开展研究,并探索此种抑制剂如何在微观层面上与冰核蛋白结合并抑制冰成核活性,以期为聚甘油在绿色作物保护和环保冷冻保护材料的开发提供理论依据。

    • AutoDock是Scripps研究所Olson实验室[25]自主开发的开源分子模拟软件,主要应用于分子对接、药物辅助设计以及虚拟筛选。自1990年发布以来,AutoDock已被证明是一种有效的分子模拟工具,能够快速、准确的预测配体与大分子靶标的结合构像。AutoDock软件由autogrid和autodock 两个子程序组成,其中autogrid主要负责格点中相关能量的计算,而autodock则负责构象搜索及评价。AutoDock计算分4步进行:(1)使用图形化界面工具AutoDockTools (ADT)软件准备坐标文件;(2)使用autogrid预先计算原子亲和力;(3)使用autodock进行配体与受体的对接;(4)使用ADT分析对接结果。

      本次模拟计算方法为拉马克遗传算法(Lamarckain Genetic Algorithm)[25-26]。拉马克遗传算法结合了局部搜索和遗传算法,可以提供有效的全空间覆盖和局部搜索优化,利用遗传算法生成配体结构种群,并进行迭代优化对全部搜索空间进行采样。在Autodock打分结果中,结合能(Binding Energy)、抑制常数(Inhibition constants, ki)是两个主要标准。结合能表示蛋白质与小分子的结合能力,抑制常数是配体和受体对接复合物亲和力的表征常数。有关结合能的公式由以下半经验公式(1)[27-29]表达:

      其中ΔGbind为结合自由能(Free Energy of Binding),ΔGvdw代表范德华作用势(van der Waals potential),ΔGhbond为氢键作用势(Hydrogen bonding potential),ΔGelect代表静电势(Electrostatic Potential),ΔGtor是二面角扭转能量(torsional energy),最后一项ΔGdesolva为去溶剂化的自由能(Free Energy of desolvation)。

    • 我们选择北方假单胞菌INP中间高度重复区基因序列597~728共132个残基,然后按照文献[13]所述的方式,首先组建16肽β-螺旋重复单元:该单元结构基于碱性蛋白酶(PDB蛋白库:1KAB)的β−螺旋结构,我们将PbINP中的SLTA和TQTA序列替换到该16肽单元的对应位置,然后使用Avogadro软件补齐SLTA和TQTA序列之间的GYGS序列和XXXS序列,形成2个并排的右旋16肽重复单元。然后通过复制的方式制作含有8个或更多的16肽单元并利用该结构模板,使用SWISSMODEL在线工具[30]根据PbINP序列597~728构建基于16肽β-螺旋结构的右旋蛋白分子。随后,我们使用GROMACS软件[31]和CHARMM力场[32]对结构进行稳定性测试。在室温25 ℃下采用真溶剂条件对上述蛋白分子进行分子动力学模拟,模拟对象为INP单体蛋白和按照文献13搭建的INP二体结构。单体和二体INP模拟采用正方盒子,边长分别为6.0 nm和7.5 nm,TIP3P水分子数为6 314和12 247。同时为了使体系保持电中性,为体系分别加入了1和2个钠离子。首先对体系进行能量最小化,然后在采用位置束缚条件下进行NVT和NPT系综下的预松弛各500 ps,模拟步长1 fs,体系压强为×105 Pa。然后放开位置束缚,采用NPT系综继续进行5 ns模拟以测试结构稳定性。使用GROMACS内部命令gmx covar获取其单体INP平均结构并能量最小化后作为我们的对接蛋白受体分子(图1所示)。

      图  1  PbINP的三维模型

      Figure 1.  Three-dimension model of PbINP

    • 在PbINP的分子模型的三维结构中,TXT结冰模板位于分子的冰联结平面(Ice−binding surface, IBS),负责形成冰核;TYR阶梯则位于IBS的侧面,负责多个INP分子之间的连接从而形成更大的结冰模板;而与IBS相对的一面没有诱导结冰作用。因此,我们主要探索配体分子和冰核蛋白的TXT平面的苏氨酸(threonine, THR)之间的结合作用,以及和酪氨酸(tyrosine, TYR)阶梯之间产生的结合作用。理论上来讲,配体分子在这两处的有效结合能够带来对INP分子结冰行为最有效的抑制作用(图1b1c)。

      首先使用AutoDock 4.2对甘油分子、三聚甘油分子和INP蛋白的PDB文件进行处理加工成PDBQT文件,包括去水、加氢和计算点电荷。其中酪氨酸阶梯残基序号是(18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130),TXT平面苏氨酸残基序号是(5, 7, 21, 23, 37, 39, 53,55, 69, 71, 85, 87, 101, 103, 117, 119, 133, 135),考虑到两种小分子配体在对接过程中可能结合多个氨基酸残基,设置小分子配体每次分别对接INP分子的酪氨酸阶梯和TXT结冰面苏氨酸残基的多个氨基酸组合位置(如表1表2)。我们设置了一个较大的网格对结盒子,能够容纳配体分子和所选的全部对接残基,晶格间距为默认的0.375Å,对接次数为500次,甘油分子和三聚甘油分子对接INP蛋白的结合构象的聚类分析的RMSD公差分别为0.20 nm和0.40 nm。

      LigandResidue
      site
      Binding energy/
      (kcal·mol−1)
      ki/
      (μmol·L−1)
      Number of
      same clusters
      Glycerol18, 34, 50−3.81630157
      −4.87267.1523
      50, 66, 82−3.5272097
      −4.76323.2240
      98, 114, 130−4.13946.8583
      −4.81295.7152
      Triglycerol18, 34,5 0,
      66, 82
      −3.721870234
      66, 82, 98,
      114, 130
      −4.63404.52162

      表 1  配体分子与酪氨酸残基对接结果

      Table 1.  Result of ligand molecule docking TYR residues

      LigandResidue
      site
      Binding energy/
      (kcal·mol−1)
      ki/
      (μmol·L−1)
      Number of
      same clusters
      Glycerol5,7,21,23,37, 39−5.4798.41122
      −6.898.9372
      53,55,69,71,
      85 ,87
      −6.1829.32152
      101,103,117,
      119,133,135
      −6.4119.92186
      Triglycerol5,21,37,53−5.5782.22155
      7,23,39,55−3.821580187
      −5.37115.98108
      37,53,69,85−5.25142.24233
      39,55,71,87−4.8303.56292
      85,101,117,133−5.0217.51139
      87,103,119,135−6.839.78249

      表 2  配体分子与苏氨酸残基对接结果

      Table 2.  Result of ligand molecule docking THR residues

    • 在采用文献提供的INP分子单体和二体结构进行构建过程后,我们使用分子动力学模拟检验了结构的稳定性。在稳定性检测的模拟时间内,发现INP单体和二体的结构变化对应的位置均方根偏差(RMSD)在0.25 nm和0.20 nm附近形成平台区(图2a),其曲线特征与文献中给出的结构稳定性检测结果基本相同13。在模拟结束后,单体INP结构中TYR阶梯结构(图2b图2c结构左侧)和TXT模板结构(图2b中部、图2c结构下方)都具有较好的稳定性;整个INP分子的右旋β−螺旋折叠结构非常完整。图2d图2e给出了模拟结束后,INP二体不同角度的结构视图。可以看到两个INP分子通过TYR残基形成的阶梯结构形成了较强的相互作用,在模拟过程中,虽然每个INP分子的β−螺旋折叠结构出现了一定的左旋,但二体结构相对位置没有出现明显的改变。

      图  2  冰核蛋白模拟过程中产生的结构相对于初始结构的均方根偏差(RMSD),以及模拟结束时INP单体和二元体的空间结构视图(其中图(c)和(e)是图(b)和(d)中结构的俯视图)

      Figure 2.  Root mean square deviation (RMSD) of the structure produced during the simulation of ice nucleation protein with respect to the initial structure, and the views of the spatial structure of INP monomer and binary body at the end of simulation (in which Fig. (c) and (e) are the top views of the structures in Fig. (b) and (d)).

    • 两种配体小分子与PbINP受体分子的TYR阶梯结构的对接模拟结果显示,小分子抑制剂有可能通过破坏TYR阶梯之间的结合来破坏多个INP分子通过该阶梯形成聚集体的诱导结冰过程。

      AutoDock计算得出甘油分子和三聚甘油分子分别与TYR各残基组结合位点的结合能。从表1可以看出, 两种配体与INP的对接模拟结果都说明在一定的浓度下可以与冰核蛋白的TYR阶梯结构产生结合。甘油分子作为配体与TYR阶梯结构对接的构象聚类结果中,最低结合能和最佳构象并不归于同一簇类(当最低结合能构象所在簇和聚类分析最佳构象所在簇不重合时,先后按照最佳聚类构象和最低结合能构象的顺序在表1表2的所属对接残基组对接信息中表示)。残基组合为 (18, 34, 50) 的分簇结果最好,在500次对接中最大簇构象数目为157,结合能为−3.8 kcal/mol(1 kcal=4.12 kJ),抑制常数为1630 μmol/L

      三聚甘油的对接结果显示最低结合能和最大簇属于同一簇类。TYR (66, 82, 98, 114, 130) 残基组的结合能较为优异,为−4.63 kcal/mol,抑制常数为404.52 μmol/L,最大簇构象数目为162。选择甘油分子对接TYR残基组(18, 34, 50)的最大簇(图3a)、对接(98, 114, 130)残基组的最低结合能构象(图3b)和三聚甘油对接(66, 82, 98, 114, 130)残基组的最低结合能构象(图3c)使用分子可视化软件Pymol[33]分析甘油和三聚甘油与INP蛋白TYR的结合模式。由于甘油和三聚甘油为多羟基线性分子,其与TYR残基结合时不限于单个TYR残基,而是通过氢键方式同时结合多个TYR残基。

      图  3  配体分子与PbINP的结合模式

      Figure 3.  Binding modes of ligand molecule and PbINP

    • 这一部分,我们考察配体小分子是否会和直接参与INP诱导结冰的TXT模板结构单元之间产生结合,从而破坏INP诱导结冰过程。首先将两种配体分子与TXT平面的THR残基通过AutoDock对接模拟并聚类分析。与上一部分的TYR阶梯结构对接结果相比,在与TXT模板结构的对接模拟中,配体抑制剂分子与THR残基之间产生了更强的结合,团簇分析中最低结合能与最大团簇的重合率明显好于前者。

      通过表2结合能等各项分析可知:甘油分子的聚类结果最好的是对接THR残基组(101, 103, 117, 119, 133, 135),结合能和抑制常数最小,分别为−6.41 kcal/mol和19.92 μmol/L,所在簇构象数目为186。同时THR基组(5, 7, 21, 23, 37, 39)聚类结果中最低结合能所在团簇与最大团簇不重合,但仍然表达出优异的结合

      信息,最低结合能为−6.89 kcal/mol,抑制常数为8.93 μmol/L。三聚甘油分子对接THR基组(87, 103, 119, 135) 的聚类结果和结合信息最好,最低结合能为−6.83 kcal/mol,抑制常数为9.78 μmol/L,所在簇分类构象数目为249。选择甘油分子对接THR基组(5, 7, 21, 23, 37, 39)的最低结合能构象(图3(d))和对接基组(101, 103, 117, 119, 133, 135)的最优构象(图3(e))以及三聚甘油分子对接THR基组(87, 103, 119, 135)的最优构象(图3(f))分析两种配体在TXT模板的结合模式。发现甘油分子在TXT结冰模板发生作用时不仅与THR残基发生结合,同时甘油分子的羟基与INP蛋白内部的谷氨酰胺(Glutamine, GLN)的氨基也产生了氢键作用,谷氨酰胺残基是维持β螺旋稳定的残基之一(图3(d))。甘油分子同样能够结合多个THR残基,如图3(e)中线性的甘油分子插入TXT结冰模板上方,与所选择残基组(101, 103, 117, 119, 133, 135)中的四个THR残基通过氢键作用结合。而分子量更大的三聚甘油分子的结合模式更加多样化,比如INP蛋白上的精氨酸(Arginine, ARG)和丙氨酸(Alanine, ALA)的氨基同样与三聚甘油的羟基发生了氢键结合(图3(f))。相比TYR阶梯,较大的TXT结冰面上本身的特性和更多的残基提供了甘油分子和三聚甘油分子更多的结合模式,使得配体分子在TXT面结合的更牢固。

    • 自冰核蛋白被发现以来,关于研究冰核蛋白的冰成核原理和如何抑制其冰核行为一直是许多研究者的关注重点。在本次研究中,我们运用AutoDock 4.2软件分析甘油分子和三聚甘油分子与冰核蛋白PbINP分子的TXT平面的THR残基和侧链TYR阶梯的对接结果,结果显示配体分子能够通过在该对应位置形成结合进而破坏北方假单胞菌的冰成核活性。

      (1)对于TYR阶梯结构,甘油的结合能和抑制常数较优,说明甘油分子与TYR残基结合的更稳固,从而破坏INP分子二聚体的形成,降低INP的结冰诱导能力。在配体分子与THR结冰模板结构的对接结果中,甘油分子和三聚甘油分子对接THR残基位点的结合能和抑制常数都较为优异,说明两种配体分子可以通过干扰TXT结冰模板的功能来抑制INP的诱导结冰行为。

      (2)比较两种小分子对接不同残基的结合信息和结合模式,可以发现TXT结冰模板对这两种小分子的吸引力更强于TYR残基。有趣的是PbINP分子上的其他残基如GLN和ARG等也为两种配体的结合作出了贡献,其对冰核蛋白结冰能力的影响有待进一步研究。

      本次对接模拟研究所选择受体为冰核蛋白的TXT平面和TYR阶梯,在其他INP分子中可能普遍存在,因此本文所揭示的抑制机理具有一定的普适性。配体是工业生产中常见的聚甘油分子,是环保绿色的工业产品。相信此次工作能对研究冰核蛋白微观结构的性质和聚甘油冰核抑制剂材料的工业开发奠定理论基础。

(3)  表(2) 参考文献 (33)

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