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绿茶是中国的主要茶类之一，含有丰富的多酚类成分。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是茶多酚的主要成分之一，占毛茶总重的9%~13%，占茶多酚总重的40%~50%[1]。随着人们对茶多酚研究的深入，EGCG的药理作用得到了广泛的认可，日常适当饮用含EGCG的饮品对身体大有裨益。绿茶和EGCG的潜在健康益处包括化学预防、抗氧化作用、杀菌、改善心血管健康、减肥、皮肤免受电离辐射造成的损害等，尤其是其抗肿瘤能力。经发现，EGCG对肾上腺、膀胱、乳腺、宫颈、结直肠、食管、胃、肝、肺、口腔、卵巢、胰腺、前列腺和皮肤等多种癌细胞具有体外抗癌作用[2-4]。
在中国乃至全世界，乳腺癌是威胁女性健康的主要恶行肿瘤之一，随着医疗科技的进步，乳腺癌的治疗取得良好进展。据2018年美国国立健康组织报道，乳腺癌的5年存活率高达90%。但乳腺癌仍然已经超越宫颈癌，成为导致女性死亡人数第一的恶行肿瘤[5-6]。乳腺癌死亡率居高不下的主要原因是具有易复发和易远端转移的特点[7]。三阴性乳腺癌作为高侵袭力的乳腺癌亚种，由于缺乏靶向药物作用的受体，治疗后三年的复发率更是高于其他亚型，导致三阴性乳腺癌的治疗面临着巨大挑战[8-9]。
有研究报道，EGCG能够抑制乳腺癌的生长且对正常乳腺细胞几乎没有毒性，可以作为治疗三阴性乳腺癌的潜在药物[10-12]。近年来，大量研究报道EGCG具有抗乳腺癌活性，然而其分子机制尚不完全明确，需要更多研究加以揭示。众所周知，癌症的发病机理错综复杂，而且药物发挥作用往往通过多靶点、多通路，故“一个药物，一个靶点，一种疾病”的模式已经不适应发展趋势[13-15]。网络药理学作为一门新兴学科，能够通过数据库挖掘“药物-疾病”靶点，并构建“靶点-靶点”相互作用和“靶点-通路”相互作用，为药物作用机理的探索和发现带来极大的便利[16]。
本文从EGCG和三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231为切入点，基于数据库挖掘，结合网络药理学和体外实验，探究EGCG作用于三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的机理，为EGCG治疗三阴性乳腺癌提供新思路。
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使用TCMSP数据库 (http://tcmspw.com/tcmsp.php)，GeneCards数据库(https://www.genecards.org/) (Relevance score>1.5) 以及Swiss Target Prediction 数据库 (http://www.swisstargetprediction.ch/) (Probability*>0.8) 挖掘EGCG的潜在靶点蛋白，利用Uniprot数据库 (https://www.uniprot.org/) 将蛋白名称转换为对应的基因名称 (Gene Symbol)，将上述获得的所有靶点取并集，得到EGCG的潜在靶点。另外，使用GeneCards数据库 (Relevance score>5) 寻找与MDA-MB-231相关的潜在疾病靶点，与EGCG的蛋白靶点映射取交集后，获得EGCG与MDA-MB-231共同作用的潜在靶点，绘制韦恩图。
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使用String version 11.0 (https://string-db.org/) 和Cytoscape 3.8.0 软件构建PPI (Protein-protein interaction)互作网络关系。在String中选择物种“Homo sapiens”，将蛋白关系评分设置为≥0.9，隐藏游离蛋白。利用cytoHubba插件中的MCC（Maximal Clique Centrality）算法，计算接近中心度，筛选排名前30的核心靶基因（Hub基因），最后将得到的数据导入Cytoscape中作图。
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使用Metascape (https://metascape.org/) 进行GO (Gene Ontology) 和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 富集分析。将1.2中筛选得到的30个关键靶点蛋白基因名导入Metascape，选择“Custom Analysis”进行精确分析，物种选择“H.Species”，设置P-Value≥0.01，然后点击“Enrichment Analysis”分别进行：生物过程 (Biological process, BP) 和KEGG分析。最后整理KEGG富集结果，在Cytoscape绘制“靶点-信号通路”互作图。
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使用PDB数据库 (https://www.rcsb.org/) 下载β-catenin (PBD ID: 1LUJ) 的晶体结构，在PDB数据库的搜索栏输入β-catenin，选择PBD ID: 1LUJ的β-catenin/ICAT复合物三维立体结构，选择“PDB”格式并下载。将下载好的“PDB”文件用PyMOL软件打开，选中复合物中的ICAT部分，在对话框中输入“Remove sele”，去除ICAT，得到β-catenin的晶体结构。使用NCBI数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure) 下载EGCG的三维立体结构 (PubChem SID:96079440)。使用AutoDockTools-1.5.6对β-catenin和EGCG进行预处理，包括加氢、去水和计算电荷。将已经预处理的β-catenin和EGCG分别通过AutoDockTools-1.5.6软件的“Grid->Macromolecules/Ligands->Open”导入。接着设置GridBox，调整X,Y,Z轴及中心坐标轴，将β-catenin整个蛋白涵盖在Gridbox中，设置结束后，点击“Grid->Output->Save GPF”保存。通过“Run->Run Autogrid”运行Autogrid，运行结束后打开蛋白和小分子，设置算法和对接参数，最后点击“Run->Run AutoDock”进行分子对接。对接图片使用PyMOL软件进行处理。
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三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231，购于上海中国科学院生物化学与细胞生物研究所
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DMEM培养基、胰蛋白酶细胞消化液：江苏凯基生物技术股份有限公司；胎牛血清：美国Gibco公司；ECL显影液、Western-IP裂解液：上海碧云天生物技术有限公司；PVDF膜：英国Whatman公司；抗β-catenin抗体、抗β-actin抗体、羊抗兔hP二抗：北京博奥森生物技术有限公司；牛血清白蛋白：生工生物工程（上海）股份有限公司；HGF细胞因子：北京义翘神州科技有限公司；EGCG：南京春秋生物工程有限公司。
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细胞培养箱：美国Thermo Fisher公司；双向垂直电泳仪、电转仪：北京市六一仪器厂；化学发光成像系统：上海天能科技有限公司。
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将MDA-MB-231分别用20 μM EGCG，40 ng/mL HGF以及EGCG和HGF联合预处理48 h，收集细胞总蛋白，以每孔40 ng的上样量进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，200 mA 恒流3 h将蛋白转至PVDF膜上，5% BSA封闭2 h后孵育一抗过夜（1：500稀释），次日清洗膜与二抗（1：2000稀释）孵育2 h。置于化学发光成像仪下观察并拍照。
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通过检索“EGCG”，在TCMSP中，获得141个靶点，删除和乳腺癌无关的靶点后保留21个；在Swiss Target Prediction中搜索“EGCG”，设置Probability≥0.8后，获得16个靶点；通过GeneCards挖掘到537个EGCG潜在作用蛋白，其中Relevance score≥1.5的蛋白靶点有215个。对3个数据库取合集后，最终获得全方靶点246个。在GeneCards数据库检索“MDA-MB-231”获取疾病靶点，筛选Relevance score≥5的阈值，得到181个靶点。将两者取交集，得到88个靶点蛋白，如图1所示。
图 1 EGCG和MDA-MB-231共同潜在靶点筛选
Figure 1. Screening of common and potential targets for EGCG and MDA-MB-231
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将EGCG和MDA-MB-231的共同核心靶点导入到String中，得到蛋白互作网络图，如图2(a)所示。同时将数据信息导入Cytoscape进行可视化处理，得到图2(b)所示的核心靶点网络交互图，图中方块的面积表示该靶点的“degree”值，面积随着节点的互作边数量的增加而增大；方块的颜色表示MCC值，颜色越深说明该靶点在该网络中的地位越靠近中心位置。其中MAPK3、SRC和MAPK1是Degree值和MCC值均处于前3的靶点。核心靶点详情见表1。
图 2 核心靶点网络互作图
Figure 2. Network interaction of core targets
Gene Protein name MAPK14 Mitogen-activated protein kinase 14 AKT1 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase MAPK3 Mitogen-activated protein kinase 3 SP1 Transcription factor Sp1 MAPK8 Mitogen-activated protein kinase 8 SRC Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src IGF1 Insulin-like growth factor I VEGFA Vascular endothelial growth factor A MET Hepatocyte growth factor receptor JUN Transcription factor AP-1 HGF Hepatocyte growth factor SMAD3 Mothers against decapentaplegic homolog 3 FOS Proto-oncogene c-Fos RB1 Retinoblastoma-associated protein ITGB1 Integrin beta-1 PTK2 Focal adhesion kinase 1 RELA Transcription factor p65 PIK3CA Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha isoform BCL2L1 Bcl-2-like protein 1 STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3 ESR1 Estrogen receptor NFKB1 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit MAPK1 Mitogen-activated protein kinase 1 CDKN1A Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 EGFR Epidermal growth factor receptor EGF Epidermal growth factor CTNNB1 Catenin beta-1 BCL2 Apoptosis regulator Bcl-2 CDH1 Cadherin-1 TP53 Cellular tumor antigen p53 表 1 EGCG和MDA-MB-231共同潜在靶点
Table 1. Common and potential targets for EGCG and MDA-MB-231
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GO和KEGG富集分析如图3所示，其中圆圈的大小随着基因数量的增多而增大；圆圈颜色的深浅随着显著性-log10(P-value)的增大而变深；横坐标表示基因数量占某个生物进程或信号通路总基因数的百分比。GO生物过程富集结果显示，核心靶点主要参与：促进细胞迁移、腺体发育、细胞氧化应激、调节DNA结合转录因子活性等。
图 3 核心靶点的GO (A) 和KEGG (B) 分析
Figure 3. GO (A) and KEGG (B) analysis of core targets
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处理KEGG富集结果，将数据导入Cytoscape软件将“靶点-通路”互作网络可视化，如图4所示。该图呈现出30个核心靶点与16条高富集通路的互作网络，有利于直观地观察“蛋白-通路”之间的关系。
图 4 核心靶点-信号通路互作图
Figure 4. The interactions between core targets and pathways
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通过GO富集分析，获得了2个高度连接的子网络，即聚类模块（图5）。代表某些蛋白互作的关键特征，并且可能包含特殊的生物进程[17]。模块1包含：内分泌抵抗通路（hsa01522），乙型肝炎通路（hsa05161）和催乳素信号通路（hsa04917）；模块2包含:乳腺癌通路（hsa05224），癌症通路（hsa05200）和黑色素瘤通路（hsa05218）。
图 5 核心聚类模块
Figure 5. Core clustering modules
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图5核心聚类模块分析得到的7个关键蛋白中，β-catenin（CTNNB1编码产物）、AKT1、RB1和FOS为胞内关键调控因子，其中β-catenin既与细胞因子（EGF、HGF）及其受体(EGFR)有关，又与上述胞内其他关键调控因子有联系。为验证EGCG与MDA-MBA-231细胞共同作用靶蛋白β-catenin的结合情况，以EGCG为配体，β-catenin为受体，使用Autodock软件进行半柔性对接，得到如图6所示的分子对接图。图中可见，EGCG可与β-catenin的568位谷氨酸（Glu568）和571位谷氨酸（Glu571）残基形成两个氢键。
图 6 EGCG与β-catenin的分子对接图
Figure 6. Moleculer Docking of EGCG to β-catenin
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为验证EGCG可通过HGF/CTNNB1通路抑制MDA-MB-231细胞的相关活性，我们Western Blot实验分析了对照组、HGF诱导组以及EGCG和HGF联合处理组的β-catenin的蛋白表达量的变化，结果见图7。由图可见，与对照组相比，经过30 ng/mL的HGF诱导后，β-catenin的表达量显著增加；EGCG和HGF联合处理后，β-catenin的表达量逐渐下降，且下降幅度与EGCG的浓度呈剂量依赖性，200 μmol/L的EGCG处理后的β-catenin的表达量减少到与对照组相当水平。
图 7 Western Blot 检测β-catenin蛋白的表达
Figure 7. The expression of β-catenin identified by Western Blot analysis
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我国的茶文化历史悠久，可以追溯到三千多年前。茶主要分为绿茶、红茶和乌龙茶，其中，绿茶是一种不经过发酵而直接高温炒制的茶，因此茶多酚等活性成分得以保留[18]。EGCG是茶多酚的主要成分，其抗肿瘤作用在多篇报道中得以证实[4, 19-20]。三阴性乳腺癌是雌激素、孕激素和Her2受体均为阴性的乳腺浸润性癌，由于缺乏普遍性的靶点，三阴性乳腺癌的治疗主要采用化疗方法，但是化疗对普通细胞的毒性大，给患者带来极大痛苦[21-23]。使用饮食中的天然物质辅助治疗和预防癌症的概念正受到越来越多的关注。有研究发现，EGCG能显著抑制的三阴性乳腺癌的生长而对正常乳腺细胞几乎没有毒副作用，说明EGCG具有治疗三阴性乳腺癌的潜能[11-12]。
基于药物“多靶点，多通路”作用的思路，本文使用网络药理学对EGCG和MDA-MB-231的潜在靶点进行挖掘，构建“PPI网络”和“蛋白-通路网络”，发现了多个EGCG作用于MDA-MB-231的潜在靶点及多条潜在信号通路，为EGCG作为治疗三阴性乳腺癌药物的开发提供了参考。
首先，本研究通过PPI网络互作获得30个核心靶点，将核心靶点导入到Cytoscape中进行可视化分析并按照“degree”值（交互数量）排序，如图2B所示。其中MAPK3、SRC和MAPK1是Degree值和MCC值均处于前3的靶点。30个核心靶点的基因名及编码的蛋白质如表1所示，将核心靶点进行GO富集分析发现，EGCG可能通过以下生物进程抑制MDA-MB-231活性，如调节细胞迁移，腺体发育过程，细胞氧化应激，调节DNA结合转录因子活性，调节细胞蛋白定位，响应生长因子刺激，生长发育，响应毒性耐受，代谢途径负调控，表皮细胞迁移，凋亡信号通路，调控结合能力，蛋白激酶B信号，响应机械刺激，生殖结构发育，响应辐射，调控DNA代谢途径，肽基酪氨酸磷酸化，正向调控蛋白定位的形成等（图3A）。这些生物进程和乳腺癌的发生和转移的细胞学机制密切相关。例如，乳腺作为腺体的一种，由基质细胞和上皮细胞组成，两者之间的通讯中断会诱发并促进乳腺癌，即乳腺异常发育对乳腺癌的发生至关重要[24]。三阴性乳腺癌的高迁移性和侵袭力实现了原发肿瘤向其它部位转移的可能，诊治后3年内远处复发发生率和内脏转移发生率高，是乳腺癌患者存活率低的主要原因[8-9]。因此，我们认为EGCG和三阴性乳腺癌的发生和转移机制相拮抗，以抑制细胞迁移，促进乳腺正常发育，抗氧化，调节基因转录等方式来预防和治疗MDA-MB-231，这与众多相关报道吻合[25-27]。KEGG富集分析显示，EGCG作用于MDA-MB-231可能参与的信号通路包括：癌症信号通路，内分泌抵抗通路，胰腺癌通路，直肠癌通路，小细胞肺癌通路，FoxO信号通路，VEGF信号通路，线粒体信号通路，癌症相关小RNA通路等（图3B）。有研究报道，内分泌抵抗会导致其它受体蛋白的高表达（如FGFR1，Her2），而通过下调该蛋白的表达能逆转耐药并达到治疗的目的[28-30]。而FoxO信号通路参与细胞增殖、细胞周期控制、细胞凋亡、细胞分化、代谢和DNA损伤修复等多种功能[31]。说明EGCG不仅对癌症有预防和治疗作用外，还可能通过恢复雌激素受体基因的表达和促进细胞凋亡来抑制MDA-MB-231活性。将KEGG富集结果导入到Cytoscape软件中进行可视化分析，可进一步分析靶点和信号通路之间的联系，结果如图4所示。
基于String的核心蛋白网络互作构建，获得MAPK3,SRC,MAPK1,AKT1,MAPK8这5个关键核心基因（按照Degree从大到小排序），这5个靶点在EGCG抑制MDA-MB-231活性中发挥着重要的作用（图2）。通过核心聚类模块分析获得2个核心子网络，其中包含7个基因（EGFR，CTNNB1，EGF，RB1，FOS，HGF和AKT1）的模块2（图5）和乳腺癌通路存在关联性。在这些基因中，HGF和EGF的蛋白产物属于细胞因子，可分别与HGFR和EGFR特异性结合进而激活下游信号通路；FOS和RB1的蛋白产物是转录因子，在调控细胞生长、分裂、增殖等方面具有重要的作用；AKT1基因编码一种丝苏氨酸特异性蛋白激酶，通过其丝苏氨酸激酶介导PI3K信号传导途径，上游信号途径为EGFR，参与细胞活力与增殖的控制，抑制细胞凋亡和促进细胞周期进展；CTNNB1基因编码的蛋白β-catenin是一种粘着连接蛋白，与钙粘蛋白（E-cadherin）、α-catenin共同组成粘附连接复合体的，通过调控细胞生长以及细胞间的粘附，对上皮细胞层的构建与维持起着重要作用。核心聚类模块2的预测结果与已有研究报道一致，如Bigelow等发现EGCG可抑制HGF诱导的Met磷酸化以及AKT和ERK的下游活化，并下调HGF诱导的乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力[32]；Sen T等人发现EGCG通过抑制相关的调节激酶下调EGF诱导的MMP-9的表达从而抑制MDA-MB-231的迁移[33]；Hong等证实EGCG通过使β-catenin信号通路失活抑制MDA-MB-231细胞的生长[34]。
由于聚类模块中CTNNB1基因编码的蛋白β-catenin是将信号从细胞质传递到细胞核的关键蛋白，且在核心聚类模块中具有较为丰富的网络关系，因此本研究选择CTNNB1进一步探讨。有文献报道，Wang等人利用热点分析法解析了β-catenin和T细胞因子结合蛋白-4（TCF4, 在核内与β-catenin结合并诱导下游信号通路的激活的蛋白质）在晶体结构中的相互作用，发现了β-catenin上的三个“热点”（A、B和C位点）对TCF4的结合至关重要。其中，A位点由许多极性残基（包括Glu571）组成，对于β-catenin与TCF4的结合以及β-catenin介导的增殖信号都是至关重要的[35]。而本文的分子对接结果显示，EGCG也可与β-catenin的上述A位点中的Glu571残基形成氢键（图6），暗示EGCG可能通过和TCF4竞争性结合β-catenin，进而抑制下游信号通路的激活。
最后，本文通过实验验证聚类模块中与CTNNB1具有网络关系的HGF是否参与了EGCG对MDA-MB-231的抑制作用。结果显示（图7），HGF能够诱导β-catenin的表达，而EGCG能显著抑制HGF诱导的β-catenin的表达上调，证实EGCG能够通过HGF/β-catenin参与MDA-MB-231细胞功能的调节。有研究报道，β-catenin、E-cadherin（表皮钙粘蛋白）和Met（HGFR，肝细胞生长因子受体）共定位于细胞接触区，HGF激活Met引起β-catenin磷酸化以及E-cadherin表达量的降低，导致细胞间黏附丧失和转移潜力增强[36-37]。因此，EGCG或许通过阻断HGF对Met的激活作用抑制β-catenin的表达。同时也为Bigelow R L等人报道的“EGCG能抑制HGF诱导的MDA-MB-231细胞迁移”提供理论参考[32]。总之，体外实验结果和模块分析预测结果吻合。
综上所述，本研究通过网络药理学发现EGCG通过多靶点，多途径发挥抗MDA-MB-231活性，探讨了EGCG作用于MDA-MB-231的关键活性靶点，核心生物进程和潜在信号通路，并通过体外实验初步验证了EGCG对MDA-MB-231核心子网络HGF/CTNNB1的调控作用。尽管本研究还存在一定的局限性，如基于网络药理学和体外实验还不足以验证EGCG的抗肿瘤效应，还需进一步通过动物实验和临床试验加以研究，但从较整体的层面分析了EGCG和MDA-MB-231的互作关系，为深入研究EGCG治疗三阴性乳腺癌的机制奠定了基础并提供了新思路。
基于网络药理学探究EGCG干预MDA-MB-231细胞的潜在分子机制
Exploration of the Mechanism of EGCG Against MDA-MB-231 cells based on Network Pharmacology
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摘要: 基于网络药理学分析绿茶中的主要多酚物质表没食子儿茶素没食子酸酯 (Epigallocatechin gallate, EGCG)对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的潜在作用靶点及其分子机理。使用数据库检索EGCG和MDA-MB-231的潜在靶点，两者的靶点基因相互映射取交集，获得共同作用靶点；借助Cytoscape 3.8.0软件绘制“靶点-通路”网络互作图、String数据库构建靶点蛋白的互作网络关系 (Protein-protein interaction，PPI)，基于Metascape平台对靶点进行基因本体论 (Gene Ontology，GO) 和京都基因与基因组百科全书 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) 富集分析；通过分子对接和体外实验验证预测结果。结果表明：通过挖掘，共获得EGCG靶点537个，MDA-MB-231靶点181个，取交集获得88个共同潜在靶点，进一步筛选保留30个核心作用靶点；获得20条核心GO生物进程和17条KEGG信号通路，涉及到癌症信号通路，毒性耐受通路，胰腺癌通路、直肠癌通路，小细胞肺癌通路等；分子对接结果显示，EGCG可以通过非共价键与β-连环蛋白 (β-catenin) 结合；体外实验表明，肝细胞生长因子 (Hepatocyte growth factor，HGF) 能够诱导β-catenin的表达，而EGCG能够抑制HGF诱导的β-catenin的表达上调。EGCG可以通过多靶点、多途径干预MDA-MB-231，其中，已经初步证实EGCG可以影响HGF/β-catenin途径，为进一步机理探究提供理论和实践基础。
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关键词:
- 表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG) /
- 三阴性乳腺癌 /
- 网络药理学 /
- 分子对接 /
- 作用机理
Abstract:ObjectiveTo screen out the potential targets and molecular mechanisms of Epigallocatechin gallate (EGCG) in the treatment of triple negative breast cancer (MDA-MB-231). MethodDatabases was used to explore the potential targets between EGCG and MDA-MB-231. The “target-pathway” networks of common targets were constructed using Cytoscape 3.8.0 software, while the String database was used to draw and analyze the PPI network. Subsequently, the core genes were submitted to the Metascape database for GO and KEGG enrichment analysis; Finally, the prediction results were verified through the in vitro experiment. ResultsIn our study, a total of 537 EGCG targets and 181 disaster targets were obtained, 30 key targets were retained by further screening from 88 common potential targets. The result of the enrichment analysis showed that the active targets were involved in 20 core GO biological processes and 17 KEGG signaling pathways, including cancer signaling pathways, toxic tolerance pathways, pancreatic cancer pathways, rectal cancer pathways, small cell lung cancer pathways and so on. Molecular docking illuminated that EGCG could interact with β-catenin in a non-covalent manner. The in vitro experiment revealed that HGF could induce the expression of β-catenin, and EGCG could repress the HGF-induced over-expression of β-catenin. ConclusionEGCG inhibits cell viability through multiple targets and multiple pathways, among them, it has been initially confirmed that EGCG can affect the HGF / β-catenin pathway, providing a theoretical and practical basis for further mechanism exploration. -
图 1 EGCG和MDA-MB-231共同潜在靶点筛选
Figure 1. Screening of common and potential targets for EGCG and MDA-MB-231
图 7 Western Blot 检测β-catenin蛋白的表达
Figure 7. The expression of β-catenin identified by Western Blot analysis
表 1 EGCG和MDA-MB-231共同潜在靶点
Table 1. Common and potential targets for EGCG and MDA-MB-231
Gene Protein name MAPK14 Mitogen-activated protein kinase 14 AKT1 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase MAPK3 Mitogen-activated protein kinase 3 SP1 Transcription factor Sp1 MAPK8 Mitogen-activated protein kinase 8 SRC Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src IGF1 Insulin-like growth factor I VEGFA Vascular endothelial growth factor A MET Hepatocyte growth factor receptor JUN Transcription factor AP-1 HGF Hepatocyte growth factor SMAD3 Mothers against decapentaplegic homolog 3 FOS Proto-oncogene c-Fos RB1 Retinoblastoma-associated protein ITGB1 Integrin beta-1 PTK2 Focal adhesion kinase 1 RELA Transcription factor p65 PIK3CA Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha isoform BCL2L1 Bcl-2-like protein 1 STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3 ESR1 Estrogen receptor NFKB1 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit MAPK1 Mitogen-activated protein kinase 1 CDKN1A Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 EGFR Epidermal growth factor receptor EGF Epidermal growth factor CTNNB1 Catenin beta-1 BCL2 Apoptosis regulator Bcl-2 CDH1 Cadherin-1 TP53 Cellular tumor antigen p53 
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