含Kex2基因序列的pPIC9K质粒和宿主细胞毕赤酵母GS115菌株均由本实验室保存，

实验所用内切酶、连接酶和蛋白分子量标准购自Takara生物有限公司，测活底物叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-对硝基苯胺（Boc-Gln-Arg-Arg-pNA）购自Sigma公司。其他试剂均为国产分析纯。MD（Minimd Dextrose Medium）培养基（1.34 g/mL YNB，2 g/mL葡萄糖，4$ \times $10⁻⁵ g/mL 生物素），YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）培养基（1 g/mL 酵母提取物，2 g/mL 蛋白胨，2 g/mL 葡萄糖），BMGY（Buffered Glycerol-complex Medium）培养基（1 g/mL 酵母提取物，2 g/mL 蛋白胨，1.34 g/mL YNB，100 mmol/L 磷酸钾缓冲液，pH5.0，4$ \times $10⁻⁵ g/mL 生物素，1%甘油），BMMY（Buffered Glycerol-complex Medium）培养基（1 g/mL 酵母提取物，2 g/mL 蛋白胨，1.34 g/mL YNB，100 mmol/L 磷酸钾缓冲液，pH 5.0，4$ \times $10^-5 % 生物素，φ为1% 甲醇）。

使用重叠延伸PCR法构建点突变。突变位点K291在蛋白空间结构中的位置如图1所示。在Kex2蛋白酶原始序列中找到对应的核酸序列，根据毕赤酵母的偏好性设计突变引物，引物序列如表1所示。然后进行两次PCR反应得到突变后的核酸序列。经过连接、转化和筛选后，挑选阳性重组子送至生工生物(Sangon Biotech)有限公司进行测序。

图  1  Kex2蛋白酶结构示意图

Figure 1.  Three-dimensional structure of Kex2 protease

测序确认正确后进行质粒少量抽提。选取SalⅠ限制性内切酶将质粒线性化，然后使用电击转化法将线性化的质粒转化至毕赤酵母GS115中，先涂布于MD平板进行第一次筛选，然后收集菌落，重新涂布于含有同质量浓度分别为1、2、3 mg/mL 的遗传要素。G418的YPD平板进行第二次筛选。

挑取含高浓度G418的YPD平板上的单菌落至YPD液体培养基中，待菌液浓度OD₆₀₀达到2.0时，再接种至BMGY培养基中，待菌液浓度OD₆₀₀为20.0时，将菌液离心，菌体重悬于BMMY培养基中，每24 h添加终浓度为1%（体积分数）的甲醇，诱导72 h。

诱导结束后将菌液离心，将上清液进行透析，去除上清液中高浓度的磷酸盐和色素小分子，透析液为20 mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液，pH值 5.2。使用Q-FF阴离子交换柱进行纯化，并用pH值5.2，20 mmol/L NaCl，20 mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液和pH值5.2，200 mmol/L NaCl，20 mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液等体积线性洗脱，分步收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，超滤除盐后测定蛋白酶活性。

测活底物为叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-对硝基苯胺（Boc-Gln-Arg-Arg-pNA或 Boc-QRR-pNA）。该底物在405 nm处无吸光值，当Kex2蛋白酶在RR位点切割后，产生了两个片段Boc-Gln-Arg-Arg和pNA，pNA在405 nm处有吸光值，且吸光值大小与浓度成正比。

酶活力定义为：在25 ℃、pH值8.0的条件下，每分钟催化1 μmol的Boc-QRR-pNA转化为产物所需要的酶量。将Boc-QRR-pNA溶于50 mmol/L Tris-HCl、pH值8.0、2 mmol/L CaCl₂的测活缓冲液中，置于25 ℃水浴中孵育30 min以上，取3 mL底物于玻璃比色皿中，加入适量酶，在波长405 nm下，每间隔30 s记录吸光值A405，连续记录5 min，然后根据下列公式计算酶活：

其中，ΔA为测量时间段内吸光值A405的差值，V_T为测活体系总体积，ΔT为测量时长，V_S为测活体系中加入酶的体积，L为比色皿光程，L=1cm，ε为反应体系中pNA的摩尔消光系数，ε=1.02$ \times {10}^{4} $（L/mol·cm）。

按照标准配置测活底物，将底物溶解于50 mmol/L Tris-HCl、pH值8.0, 2 mmol/L CaCl₂的测活缓冲液中，置于不同温度（4、25、37、60 ℃）水浴中孵育2 h后加入适量蛋白酶测定活性。将测得的活性最高的一组作为100%，计算其他温度下蛋白酶的相对活性，以温度为横坐标，蛋白酶的相对活性为纵坐标作图。

将纯化后的Kex2蛋白酶在不同温度（4、25、37 ℃）水浴下孵育，每2 h测定一次经不同温度处理后的蛋白酶的活性。结果为3组平行实验平均值，未经处理蛋白酶的活性为100%，计算经不同温度和时间处理后的蛋白酶的残留活性，以温度为横坐标，蛋白酶的残留活性为纵坐标作图。

将测活底物分别溶解在不同的pH值缓冲液中，在25 ℃水浴中放置2 h后，加入适量蛋白酶测定活性。将测得的活性最高的一组作为100%，计算其他pH条件下蛋白酶的相对活性，以pH值为横坐标，相对活性为纵坐标作图。不同的pH值缓冲溶液包括50 mmol/L NaAc-HAc (pH值 3.0 ~ 6.0)，50 mmol/L Tris-HCl (pH值 7.0 ~ 8.0)和50 mmol/L Gly-NaOH (pH值 9.0 ~ 10.0)。

将纯化后的蛋白样品进行超滤浓缩，然后稀释至不同pH的缓冲液中，在4 ℃水浴中处理12 h后测定蛋白酶活性，结果为3组平行实验平均值。以测得的活性最高的一组作为100%，计算经不同pH缓冲液处理后的蛋白酶的相对活性，以pH值为横坐标，蛋白酶的相对活性为纵坐标作图。

利用Lineweaver-Burk双倒数作图法得到各蛋白酶的米氏常数（Km）和最大反应速率（V_max），分别配置浓度[S]为10、20、30、50、100、200、300 μmol/L的底物，在不同浓度底物下测定蛋白酶的反应速率V（μmol/min），然后以$ \dfrac{1}{V} - \dfrac{1}{\left[S\right]} $作图，拟合出一条直线，其横轴截距为−1/Km，纵轴截距为1/V_max。

在培养基中每24 h添加φ为1%甲醇进行诱导后，取样离心，后取上清液进行电泳鉴定，结果如图2（a）所示。Kex2蛋白酶的天然形式和突变体均成功表达，在甲醇的诱导下分泌到培养液中，表观分子量为75 ku。经过Q-FF纯化后，SDS-PAGE电泳检测如图2（b）显示，天然Kex2蛋白酶在纯化过程中发生了降解，出现了非单一条带，在66 ku处出现了一条杂条带，而突变体在纯化过程中未发现明显的降解，仍为单一条带。测定蛋白浓度和活性计算得到比活，天然Kex2的比活为55.6 U/g，突变体Kex2-K291H的比活为107.7 U/g，突变体Kex2-K291L的比活为143.8 U/g。

图  2  （a）天然Kex2蛋白酶和突变体的诱导表达结果（b）Q-FF纯化天然Kex2蛋白酶和突变体

Figure 2.  (a) The expression of the wild type Kex2 protease and its mutants (b) Purification of the wild type Kex2 protease and its mutants with Q-FF

采用了两种方法测定蛋白酶的最适温度。第一种方法是直接在不同温度下测定活性，结果如图3（a）所示。随着反应体系的温度升高，蛋白酶的反应速率也逐渐升高。但是考虑到该测活过程中反应时间仅为5 min，反应时间较短，而在实际应用过程中蛋白酶的加工时间要长于5 min，通常为1 h甚至更长，因此采用第二种方法测定：将蛋白酶与底物在相同的温度下分别放置30 min后，然后再将蛋白酶与底物混合进行活性测定，实验结果如图3（b）所示。两种突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L分别与天然Kex2蛋白酶进行显著性差异分析，两次计算得到的P值均大于0.05，即突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L与天然Kex2蛋白酶的最适温度差异不显著。天然Kex2蛋白酶和两种Kex2突变体的最适温度保持一致，都能在37 ℃条件下一段时间内保持较高的活性。当反应体系温度超过40 ℃后，蛋白酶无法长久保持稳定，虽然在较短时间内呈现较高活性，但随着反应时间增长，蛋白酶活性呈下降趋势。根据这两种测定方法的实验结果可以发现，若在短时间内进行测活，可以使用温度较高的反应体系；若要进行长时间反应，最好在低于37 ℃条件下进行反应。

图  3  天然Kex2蛋白酶和突变体的最适温度

Figure 3.  Optimal temperature of wild-type Kex2 protease and mutants.

蛋白酶的温度稳定性如图4所示。两种突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L分别与天然Kex2蛋白酶进行显著性差异分析，两次计算得到的P值均大于0.05，即突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L与天然Kex2蛋白酶的温度稳定性差异不显著。天然Kex2蛋白酶和突变体在相同温度下的稳定性进行比较：在4 ℃、和25 ℃条件下，两种突变体的稳定性与天然Kex2蛋白酶的稳定性都较好，24 h后仍能保留90%以上的活性。在37 ℃条件下，两种突变体和天然Kex2蛋白酶的稳定性的趋势基本相同，在12 h内均能保留90%以上的活性，但当时间延长至24 h后，蛋白酶稳定性呈下降趋势。

图  4  天然Kex2蛋白酶与突变体的温度稳定性比较

Figure 4.  Comparison of temperature stability between wild-type Kex2 protease and mutants.

最适pH实验结果如图5所示，天然Kex2蛋白酶与Kex2蛋白酶突变体的最适pH相同，均在pH值9.0的反应体系中显示较高的活性。当反应体系的pH值低于5.0时，蛋白酶的活性完全丧失；当反应体系的pH值在5.0~8.0范围内，蛋白酶的活性开始逐渐升高，在反应体系pH值为9.0时蛋白酶显示活性最高；当反应体系的pH值高于10.0时，蛋白酶活性又开始迅速降低。两种突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L分别与天然Kex2蛋白酶进行显著性差异分析，两次计算得到的P值均大于0.05，即突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L与天然Kex2蛋白酶的最适pH差异不显著。

图  5  天然Kex2蛋白酶与突变体的最适pH

Figure 5.  Optimal pH of wild-type Kex2 protease and its mutants.

天然Kex2蛋白酶和Kex2蛋白酶突变体在不同pH条件放置12 h后，残留的活性如图6所示，三者的活性变化趋势是一致的，在pH值5.0~6.0范围内，蛋白酶的活性相对稳定，但Kex2-K291H和Kex2-K291L的稳定pH范围要明显大于天然Kex2的稳定pH范围。当pH值高于7.0时，天然Kex2蛋白酶的活性开始逐渐下降，而当pH值高于8.0时，Kex2-K291H和Kex2-K291L的活性才开始下降。

图  6  天然Kex2蛋白酶与突变体pH稳定性

Figure 6.  pH stability of wild-type Kex2 protease and its mutants.

两种突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L分别与天然Kex2蛋白酶进行显著性差异分析。突变体Kex2-K291L与天然Kex2蛋白酶相比，P＞0.05，即突变体Kex2-K291L与天然Kex2蛋白酶的pH稳定性差异不显著。但突变体Kex2-K291H与天然Kex2蛋白酶相比，P=0.0379＜0.05，即突变体Kex2-K291H与天然Kex2蛋白酶的pH稳定性差异显著。

天然Kex2蛋白酶和Kex2蛋白酶突变体的Lineweaver-Burk曲线如图7所示，根据拟合后的直线计算得到各蛋白酶的动力学参数（表2）。天然Kex2蛋白酶的Km值为0.037 mmol/L，Kex2蛋白酶突变体Kex2-K291H的Km值为0.018 mmol/L，突变体Kex2-K291L的Km值为0.019 mmol/L，与天然Kex2蛋白酶相比，两种突变体的Km值均减小。突变体Kex2-K291H的Kcat/Km值为天然Kex2的1.85倍，突变体Kex2-K291L的催化效率指数（Kcat/Km）值为天然Kex2的2.05倍。

图  7  Lineweaver-Burk双倒数图分析蛋白酶的动力学参数

Figure 7.  Lineweaver-Burk plots analysis of the kinetics

Proteases	Km/(mmol·L−1)	Kcat/s−1	Kcat/Km/(mol−1·L·s−1)
Wild Kex2 protease	0.037	151	4.081$ \times {10}^{7} $
Kex2-K291H mutant	0.018	136	7.556$ \times {10}^{7} $
Kex2-K291L mutant	0.019	159	8.368$ \times {10}^{7} $

表 2  Kex2蛋白酶动力学参数

Table 2.  Kinetic parameters of Kex2 proteases

（1）利用毕赤酵母表达系统成功表达了Kex2蛋白酶K291位点的两种突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L。

（2）对比天然Kex2蛋白酶和Kex2突变体的降解情况，Kex2-K291H和Kex2-K291L的降解条带基本消失，为单一条带。

（3）与天然Kex2蛋白酶相比，突变体Kex2-K291H的稳定pH范围扩大，在pH值5.0~7.0范围内均能保持较高的稳定性。而两种突变体的最适温度、温度稳定性、最适pH仍与天然Kex2蛋白酶保持一致。

（4）突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L的催化效率提高，两者的Kcat/Km值分别为天然Kex2蛋白酶的1.85倍和2.05倍。