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  • ISSN 1006-3080
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Kex2蛋白酶K291突变体性质和动力学研究

    作者简介: 杨 帆(1995-),女,硕士生,主要研究方向为重组蛋白酶。E-mail:2258361193@qq.com;
    通讯作者: 李素霞, lisuxia@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: Q78

Properties and Kinetics of Kex2 K291 Mutants

    Corresponding author: LI Suxia, lisuxia@ecust.edu.cn
  • CLC number: Q78

  • 摘要: 利用毕赤酵母GS115表达系统,成功表达并纯化获得了两种Kex2蛋白酶突变体Kex2-K291L和Kex2-K291H。对比研究了天然Kex2和这两种突变体的酶学性质和稳定性。实验结果表明,与天然Kex2相比,Kex2-K291H和Kex2-K291L两种突变体的稳定性得到了明显的改善。两种突变体的最适pH和最适温度与天然Kex2保持一致,均为pH 9.0和37 ℃,两种突变体的温度稳定性也与天然Kex2基本一致。与天然Kex2蛋白酶相比,突变体Kex2-K291H的pH稳定性范围扩大,从5.0~6.0扩大至5.0~7.0。酶促反应动力学研究表明,突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L的Kcat/Km值分别为天然Kex2的1.8倍和2.0倍。突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L在改善天然Kex2自降解问题的同时,提高了pH稳定性和催化效率。
  • 图 1  Kex2蛋白酶结构示意图

    Figure 1.  Three-dimensional structure of Kex2 protease

    图 2  (a)天然Kex2蛋白酶和突变体的诱导表达结果(b)Q-FF纯化天然Kex2蛋白酶和突变体

    Figure 2.  (a) The expression of the wild type Kex2 protease and its mutants (b) Purification of the wild type Kex2 protease and its mutants with Q-FF

    图 3  天然Kex2蛋白酶和突变体的最适温度

    Figure 3.  Optimal temperature of wild-type Kex2 protease and mutants.

    图 4  天然Kex2蛋白酶与突变体的温度稳定性比较

    Figure 4.  Comparison of temperature stability between wild-type Kex2 protease and mutants.

    图 5  天然Kex2蛋白酶与突变体的最适pH

    Figure 5.  Optimal pH of wild-type Kex2 protease and its mutants.

    图 6  天然Kex2蛋白酶与突变体pH稳定性

    Figure 6.  pH stability of wild-type Kex2 protease and its mutants.

    图 7  Lineweaver-Burk双倒数图分析蛋白酶的动力学参数

    Figure 7.  Lineweaver-Burk plots analysis of the kinetics

    表 1  突变引物

    Table 1.  Primers of mutants

    PrimersSequences for primers (5’ to 3’)
    FCCGGAATTCTTGGTCTCCTCTCAACAAATC
    RATAGTTTAGCGGCCGCTTATGGGGTATTTGGATC
    F291HCAGATTTGGTGAAGCATGCTTTGGTTAAGG
    R291HCCTTAACCAAAGCATGCTTCACCAAATCTG
    F291LCAGATTTGGTGAAGTTGGCTTTGGTTAAGG
    R291LCCTTAACCAAAGCCAACTTCACCAAATCTG
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    表 2  Kex2蛋白酶动力学参数

    Table 2.  Kinetic parameters of Kex2 proteases

    ProteasesKm/(mmol·L−1)Kcat/s−1Kcat/Km/(mol−1·L·s−1)
    Wild Kex2 protease0.0371514.081$ \times {10}^{7} $
    Kex2-K291H mutant0.0181367.556$ \times {10}^{7} $
    Kex2-K291L mutant0.0191598.368$ \times {10}^{7} $
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  • [1] MIZUNO K, NAKAMURA T, OHSHIMA T, et al. Characterization of KEX2-encoded endopeptidase from yeast Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1989, 159(1): 305-311. doi: 10.1016/0006-291X(89)92438-8
    [2] BRENNER C, FULLER R S. Structural and Enzymatic Characterization of a Purified Prohormone- Processing Enzyme: Secreted, Soluble Kex2 Protease[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992, 89(3): 922-926. doi: 10.1073/pnas.89.3.922
    [3] FULLER R S, STERNE R E, THORNER J. Enzymes Required for Yeast Prohormone Processing[J]. Annual Review of Physiology, 1988, 50: 345-362. doi: 10.1146/annurev.ph.50.030188.002021
    [4] MIZUNO K, NAKAMURA T, OHSHIMA T, et al. Yeast KEX2 genes encodes an endopeptidase homologous to subtilisin-like serine proteases[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1988, 156(1): 246-254. doi: 10.1016/S0006-291X(88)80832-5
    [5] FULLER R. S, BRAKE A, THORNER J. Intracellular targeting and structural conservation of a prohormone-processing endoprotease[J]. Science, 1989, 246(4929): 482-486. doi: 10.1126/science.2683070
    [6] GLUSCHANKOF P, FULLER R S. A C-terminal domain conserved in precursor processing proteases is required for intramolecular N-terminal maturation of pro-Kex2 protease[J]. The EMBO Journal, 1994, 13(10): 2280-2288. doi: 10.1002/j.1460-2075.1994.tb06510.x
    [7] FULLER R S, BRAKE A, THORNER J. Yeast prohormone processing enzyme (KEX2 gene product) is a Ca2+-dependent serine protease[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1989, 86(5): 1434-1438. doi: 10.1073/pnas.86.5.1434
    [8] LEDGERWOOD E C, GEORGE P M, PEACH R J, et al. Endoproteolytic processing of recombinant proalbumin variants by the yeast Kex2 protease[J]. Biochemical Journal, 1995, 308(Pt 1): 321-325.
    [9] WILCOX C A, FULLER R S. Posttranslational Processing of the Prohormone-Cleaving Kex2 Protease in the Saccharomyces cerevisiae Secretory Pathway[J]. The Journal of Cell Biology, 1991, 115(2): 297-307. doi: 10.1083/jcb.115.2.297
    [10] BRENNER C, FULLER R S. Structural and Enzymatic Characterization of a Purified Prohormone- Processing Enzyme: Secreted, Soluble Kex2 Protease[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992, 89(3): 922-926. doi: 10.1073/pnas.89.3.922
    [11] ROCKWELL N C, FULLER R S. 10 Yeast Kex2 protease[J]. The Enzymes, 2002, 22: 259-289. doi: 10.1016/S1874-6047(02)80011-7
    [12] ROCKWELL N C, KRYSAN D J, KOMIYAMA T, et al. Precursor processing by Kex2/Furin proteases[J]. Chemical Reviews, 2002, 102(12): 4525-4548. doi: 10.1021/cr010168i
    [13] GERMAIN D, VERNET T, BOILEAU G, et al. Expression of the Saccharomyces cerevisiae Kex2p endoprotease in inset cells. Evidence for a carboxy-terminal autoprocessing event[J]. European journal of biochemistry / FEBS, 1992, 204(1): 121-126. doi: 10.1111/j.1432-1033.1992.tb16613.x
    [14] 刘颖颖, 王之可, 李素霞. Kex2蛋白酶在毕赤酵母中的表达纯化和性质研究[J]. 中国生化药物杂志, 2015, 35(1): 37-42.
    [15] ROCKWELL N C, THORNER J W. The kindest cuts of all: Crystal structures of Kex2 and furin reveal secrets of precursor processing[J]. Trends in Biochemical Sciences, 2004, 29(2): 80-87. doi: 10.1016/j.tibs.2003.12.006
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-10-09
  • 网络出版日期:  2021-01-07

Kex2蛋白酶K291突变体性质和动力学研究

    作者简介:杨 帆(1995-),女,硕士生,主要研究方向为重组蛋白酶。E-mail:2258361193@qq.com
    通讯作者: 李素霞, lisuxia@ecust.edu.cn
  • 1. 华东理工大学生物反应器国家重点实验室,上海 200237
  • 2. 上海雅心生物技术有限公司,上海 200231

摘要: 利用毕赤酵母GS115表达系统,成功表达并纯化获得了两种Kex2蛋白酶突变体Kex2-K291L和Kex2-K291H。对比研究了天然Kex2和这两种突变体的酶学性质和稳定性。实验结果表明,与天然Kex2相比,Kex2-K291H和Kex2-K291L两种突变体的稳定性得到了明显的改善。两种突变体的最适pH和最适温度与天然Kex2保持一致,均为pH 9.0和37 ℃,两种突变体的温度稳定性也与天然Kex2基本一致。与天然Kex2蛋白酶相比,突变体Kex2-K291H的pH稳定性范围扩大,从5.0~6.0扩大至5.0~7.0。酶促反应动力学研究表明,突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L的Kcat/Km值分别为天然Kex2的1.8倍和2.0倍。突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L在改善天然Kex2自降解问题的同时,提高了pH稳定性和催化效率。

English Abstract

  • Kex2蛋白酶是一种钙离子依赖型的丝氨酸蛋白酶,可以特异性识别两个连续的碱性氨基酸(Arg-Arg或Lys-Arg或Lys-Lys)并在第二个碱性氨基酸的羧基端肽键进行切割[1-3]。Kex2蛋白酶包含814个氨基酸残基,分为七个结构域:信号肽(1~19氨基酸残基)、前肽(20~113氨基酸残基)、催化结构域(114~410氨基酸残基)、P-结构域(411~624氨基酸残基)、丝氨酸/苏氨酸富集区(625~679氨基酸残基)、跨膜区(680~699氨基酸残基)以及胞浆区(700~814氨基酸残基)[4-5]。研究发现信号肽、跨膜区和胞浆区这3个结构域与Kex2蛋白酶的活性无关,去除这些结构域不会影响蛋白酶的活性,因此在表达时通常只表达前肽至丝氨酸/苏氨酸富集区这4个结构域的氨基酸片段[6-9]

    Kex2蛋白酶在生物医药行业有广泛应用前景,相比胰蛋白酶,Kex2酶切位点更特异。为了能够得到高产量的Kex2蛋白酶,研究人员尝试了多种不同类型的表达系统,最终认为毕赤酵母表达系统表达Kex2蛋白酶效率最高[10-13]。本实验室成功利用毕赤酵母表达系统表达了含有Kex2前肽、催化结构域、P结构域和丝氨酸/苏氨酸富集区结构域的20~667位氨基酸残基序列,利用毕赤酵母α-信号肽取代原Kex2信号肽(1-19氨基酸残基),可以得到直接分泌到胞外的目的蛋白[14]。然而在纯化过程中发现,该Kex2蛋白酶会出现自降解的现象,产生多条杂条带,酶活性降低。在分析其氨基酸序列后发现,Kex2蛋白自身结构中含有多对连续碱性氨基酸残基位点,这可能是导致其自降解的原因。

    结合降解条带的分子量和蛋白结构分析后[15],筛选到了一个最有可能的潜在降解位点K290-K291。它的位点位于α-螺旋处,且该位点暴露于整个蛋白分子的表面,非常容易被识别并被切割。此外,该位点在空间结构上距离催化三联体Ser385-His213-Asp175较远,突变后不会影响蛋白酶催化活性。根据氨基酸的带电荷情况和侧链R基团,选择组氨酸(His)和亮氨酸(Leu)作为突变后氨基酸。经过分析后发现,His与原位点赖氨酸(Lys)均带正电荷,亮氨酸Leu的侧链R基团与赖氨酸Lys的侧链R基团相比,除了减少一个氨基外,碳原子个数相同,因此决定选择这两种氨基酸。

    本文将K291位点的Lys突变为His和Leu,并对突变体的降解情况和稳定性、动力学进行了研究,并将天然Kex2与突变体进行了比较。

    • Kex2基因序列的pPIC9K质粒和宿主细胞毕赤酵母GS115菌株均由本实验室保存,

    • 实验所用内切酶、连接酶和蛋白分子量标准购自Takara生物有限公司,测活底物叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-对硝基苯胺(Boc-Gln-Arg-Arg-pNA)购自Sigma公司。其他试剂均为国产分析纯。MD(Minimd Dextrose Medium)培养基(1.34 g/mL YNB,2 g/mL葡萄糖,4$ \times $10−5 g/mL 生物素),YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)培养基(1 g/mL 酵母提取物,2 g/mL 蛋白胨,2 g/mL 葡萄糖),BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium)培养基(1 g/mL 酵母提取物,2 g/mL 蛋白胨,1.34 g/mL YNB,100 mmol/L 磷酸钾缓冲液,pH5.0,4$ \times $10−5 g/mL 生物素,1%甘油),BMMY(Buffered Glycerol-complex Medium)培养基(1 g/mL 酵母提取物,2 g/mL 蛋白胨,1.34 g/mL YNB,100 mmol/L 磷酸钾缓冲液,pH 5.0,4$ \times $10-5 % 生物素,φ为1% 甲醇)。

    • 使用重叠延伸PCR法构建点突变。突变位点K291在蛋白空间结构中的位置如图1所示。在Kex2蛋白酶原始序列中找到对应的核酸序列,根据毕赤酵母的偏好性设计突变引物,引物序列如表1所示。然后进行两次PCR反应得到突变后的核酸序列。经过连接、转化和筛选后,挑选阳性重组子送至生工生物(Sangon Biotech)有限公司进行测序。

      PrimersSequences for primers (5’ to 3’)
      FCCGGAATTCTTGGTCTCCTCTCAACAAATC
      RATAGTTTAGCGGCCGCTTATGGGGTATTTGGATC
      F291HCAGATTTGGTGAAGCATGCTTTGGTTAAGG
      R291HCCTTAACCAAAGCATGCTTCACCAAATCTG
      F291LCAGATTTGGTGAAGTTGGCTTTGGTTAAGG
      R291LCCTTAACCAAAGCCAACTTCACCAAATCTG

      表 1  突变引物

      Table 1.  Primers of mutants

      图  1  Kex2蛋白酶结构示意图

      Figure 1.  Three-dimensional structure of Kex2 protease

    • 测序确认正确后进行质粒少量抽提。选取SalⅠ限制性内切酶将质粒线性化,然后使用电击转化法将线性化的质粒转化至毕赤酵母GS115中,先涂布于MD平板进行第一次筛选,然后收集菌落,重新涂布于含有同质量浓度分别为1、2、3 mg/mL 的遗传要素。G418的YPD平板进行第二次筛选。

    • 挑取含高浓度G418的YPD平板上的单菌落至YPD液体培养基中,待菌液浓度OD600达到2.0时,再接种至BMGY培养基中,待菌液浓度OD600为20.0时,将菌液离心,菌体重悬于BMMY培养基中,每24 h添加终浓度为1%(体积分数)的甲醇,诱导72 h。

      诱导结束后将菌液离心,将上清液进行透析,去除上清液中高浓度的磷酸盐和色素小分子,透析液为20 mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液,pH值 5.2。使用Q-FF阴离子交换柱进行纯化,并用pH值5.2,20 mmol/L NaCl,20 mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液和pH值5.2,200 mmol/L NaCl,20 mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液等体积线性洗脱,分步收集洗脱液,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,超滤除盐后测定蛋白酶活性。

    • 测活底物为叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-对硝基苯胺(Boc-Gln-Arg-Arg-pNA或 Boc-QRR-pNA)。该底物在405 nm处无吸光值,当Kex2蛋白酶在RR位点切割后,产生了两个片段Boc-Gln-Arg-Arg和pNA,pNA在405 nm处有吸光值,且吸光值大小与浓度成正比。

      酶活力定义为:在25 ℃、pH值8.0的条件下,每分钟催化1 μmol的Boc-QRR-pNA转化为产物所需要的酶量。将Boc-QRR-pNA溶于50 mmol/L Tris-HCl、pH值8.0、2 mmol/L CaCl2的测活缓冲液中,置于25 ℃水浴中孵育30 min以上,取3 mL底物于玻璃比色皿中,加入适量酶,在波长405 nm下,每间隔30 s记录吸光值A405,连续记录5 min,然后根据下列公式计算酶活:

      其中,ΔA为测量时间段内吸光值A405的差值,VT为测活体系总体积,ΔT为测量时长,VS为测活体系中加入酶的体积,L为比色皿光程,L=1cm,ε为反应体系中pNA的摩尔消光系数,ε=1.02$ \times {10}^{4} $(L/mol·cm)。

    • 按照标准配置测活底物,将底物溶解于50 mmol/L Tris-HCl、pH值8.0, 2 mmol/L CaCl2的测活缓冲液中,置于不同温度(4、25、37、60 ℃)水浴中孵育2 h后加入适量蛋白酶测定活性。将测得的活性最高的一组作为100%,计算其他温度下蛋白酶的相对活性,以温度为横坐标,蛋白酶的相对活性为纵坐标作图。

      将纯化后的Kex2蛋白酶在不同温度(4、25、37 ℃)水浴下孵育,每2 h测定一次经不同温度处理后的蛋白酶的活性。结果为3组平行实验平均值,未经处理蛋白酶的活性为100%,计算经不同温度和时间处理后的蛋白酶的残留活性,以温度为横坐标,蛋白酶的残留活性为纵坐标作图。

    • 将测活底物分别溶解在不同的pH值缓冲液中,在25 ℃水浴中放置2 h后,加入适量蛋白酶测定活性。将测得的活性最高的一组作为100%,计算其他pH条件下蛋白酶的相对活性,以pH值为横坐标,相对活性为纵坐标作图。不同的pH值缓冲溶液包括50 mmol/L NaAc-HAc (pH值 3.0 ~ 6.0),50 mmol/L Tris-HCl (pH值 7.0 ~ 8.0)和50 mmol/L Gly-NaOH (pH值 9.0 ~ 10.0)。

      将纯化后的蛋白样品进行超滤浓缩,然后稀释至不同pH的缓冲液中,在4 ℃水浴中处理12 h后测定蛋白酶活性,结果为3组平行实验平均值。以测得的活性最高的一组作为100%,计算经不同pH缓冲液处理后的蛋白酶的相对活性,以pH值为横坐标,蛋白酶的相对活性为纵坐标作图。

    • 利用Lineweaver-Burk双倒数作图法得到各蛋白酶的米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax),分别配置浓度[S]为10、20、30、50、100、200、300 μmol/L的底物,在不同浓度底物下测定蛋白酶的反应速率V(μmol/min),然后以$ \dfrac{1}{V} - \dfrac{1}{\left[S\right]} $作图,拟合出一条直线,其横轴截距为−1/Km,纵轴截距为1/Vmax

    • 在培养基中每24 h添加φ为1%甲醇进行诱导后,取样离心,后取上清液进行电泳鉴定,结果如图2(a)所示。Kex2蛋白酶的天然形式和突变体均成功表达,在甲醇的诱导下分泌到培养液中,表观分子量为75 ku。经过Q-FF纯化后,SDS-PAGE电泳检测如图2(b)显示,天然Kex2蛋白酶在纯化过程中发生了降解,出现了非单一条带,在66 ku处出现了一条杂条带,而突变体在纯化过程中未发现明显的降解,仍为单一条带。测定蛋白浓度和活性计算得到比活,天然Kex2的比活为55.6 U/g,突变体Kex2-K291H的比活为107.7 U/g,突变体Kex2-K291L的比活为143.8 U/g。

      图  2  (a)天然Kex2蛋白酶和突变体的诱导表达结果(b)Q-FF纯化天然Kex2蛋白酶和突变体

      Figure 2.  (a) The expression of the wild type Kex2 protease and its mutants (b) Purification of the wild type Kex2 protease and its mutants with Q-FF

    • 采用了两种方法测定蛋白酶的最适温度。第一种方法是直接在不同温度下测定活性,结果如图3(a)所示。随着反应体系的温度升高,蛋白酶的反应速率也逐渐升高。但是考虑到该测活过程中反应时间仅为5 min,反应时间较短,而在实际应用过程中蛋白酶的加工时间要长于5 min,通常为1 h甚至更长,因此采用第二种方法测定:将蛋白酶与底物在相同的温度下分别放置30 min后,然后再将蛋白酶与底物混合进行活性测定,实验结果如图3(b)所示。两种突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L分别与天然Kex2蛋白酶进行显著性差异分析,两次计算得到的P值均大于0.05,即突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L与天然Kex2蛋白酶的最适温度差异不显著。天然Kex2蛋白酶和两种Kex2突变体的最适温度保持一致,都能在37 ℃条件下一段时间内保持较高的活性。当反应体系温度超过40 ℃后,蛋白酶无法长久保持稳定,虽然在较短时间内呈现较高活性,但随着反应时间增长,蛋白酶活性呈下降趋势。根据这两种测定方法的实验结果可以发现,若在短时间内进行测活,可以使用温度较高的反应体系;若要进行长时间反应,最好在低于37 ℃条件下进行反应。

      图  3  天然Kex2蛋白酶和突变体的最适温度

      Figure 3.  Optimal temperature of wild-type Kex2 protease and mutants.

      蛋白酶的温度稳定性如图4所示。两种突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L分别与天然Kex2蛋白酶进行显著性差异分析,两次计算得到的P值均大于0.05,即突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L与天然Kex2蛋白酶的温度稳定性差异不显著。天然Kex2蛋白酶和突变体在相同温度下的稳定性进行比较:在4 ℃、和25 ℃条件下,两种突变体的稳定性与天然Kex2蛋白酶的稳定性都较好,24 h后仍能保留90%以上的活性。在37 ℃条件下,两种突变体和天然Kex2蛋白酶的稳定性的趋势基本相同,在12 h内均能保留90%以上的活性,但当时间延长至24 h后,蛋白酶稳定性呈下降趋势。

      图  4  天然Kex2蛋白酶与突变体的温度稳定性比较

      Figure 4.  Comparison of temperature stability between wild-type Kex2 protease and mutants.

    • 最适pH实验结果如图5所示,天然Kex2蛋白酶与Kex2蛋白酶突变体的最适pH相同,均在pH值9.0的反应体系中显示较高的活性。当反应体系的pH值低于5.0时,蛋白酶的活性完全丧失;当反应体系的pH值在5.0~8.0范围内,蛋白酶的活性开始逐渐升高,在反应体系pH值为9.0时蛋白酶显示活性最高;当反应体系的pH值高于10.0时,蛋白酶活性又开始迅速降低。两种突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L分别与天然Kex2蛋白酶进行显著性差异分析,两次计算得到的P值均大于0.05,即突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L与天然Kex2蛋白酶的最适pH差异不显著。

      图  5  天然Kex2蛋白酶与突变体的最适pH

      Figure 5.  Optimal pH of wild-type Kex2 protease and its mutants.

      天然Kex2蛋白酶和Kex2蛋白酶突变体在不同pH条件放置12 h后,残留的活性如图6所示,三者的活性变化趋势是一致的,在pH值5.0~6.0范围内,蛋白酶的活性相对稳定,但Kex2-K291H和Kex2-K291L的稳定pH范围要明显大于天然Kex2的稳定pH范围。当pH值高于7.0时,天然Kex2蛋白酶的活性开始逐渐下降,而当pH值高于8.0时,Kex2-K291H和Kex2-K291L的活性才开始下降。

      图  6  天然Kex2蛋白酶与突变体pH稳定性

      Figure 6.  pH stability of wild-type Kex2 protease and its mutants.

      两种突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L分别与天然Kex2蛋白酶进行显著性差异分析。突变体Kex2-K291L与天然Kex2蛋白酶相比,P>0.05,即突变体Kex2-K291L与天然Kex2蛋白酶的pH稳定性差异不显著。但突变体Kex2-K291H与天然Kex2蛋白酶相比,P=0.0379<0.05,即突变体Kex2-K291H与天然Kex2蛋白酶的pH稳定性差异显著。

    • 天然Kex2蛋白酶和Kex2蛋白酶突变体的Lineweaver-Burk曲线如图7所示,根据拟合后的直线计算得到各蛋白酶的动力学参数(表2)。天然Kex2蛋白酶的Km值为0.037 mmol/L,Kex2蛋白酶突变体Kex2-K291H的Km值为0.018 mmol/L,突变体Kex2-K291L的Km值为0.019 mmol/L,与天然Kex2蛋白酶相比,两种突变体的Km值均减小。突变体Kex2-K291H的Kcat/Km值为天然Kex2的1.85倍,突变体Kex2-K291L的催化效率指数(Kcat/Km)值为天然Kex2的2.05倍。

      图  7  Lineweaver-Burk双倒数图分析蛋白酶的动力学参数

      Figure 7.  Lineweaver-Burk plots analysis of the kinetics

      ProteasesKm/(mmol·L−1)Kcat/s−1Kcat/Km/(mol−1·L·s−1)
      Wild Kex2 protease0.0371514.081$ \times {10}^{7} $
      Kex2-K291H mutant0.0181367.556$ \times {10}^{7} $
      Kex2-K291L mutant0.0191598.368$ \times {10}^{7} $

      表 2  Kex2蛋白酶动力学参数

      Table 2.  Kinetic parameters of Kex2 proteases

    • (1)利用毕赤酵母表达系统成功表达了Kex2蛋白酶K291位点的两种突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L。

      (2)对比天然Kex2蛋白酶和Kex2突变体的降解情况,Kex2-K291H和Kex2-K291L的降解条带基本消失,为单一条带。

      (3)与天然Kex2蛋白酶相比,突变体Kex2-K291H的稳定pH范围扩大,在pH值5.0~7.0范围内均能保持较高的稳定性。而两种突变体的最适温度、温度稳定性、最适pH仍与天然Kex2蛋白酶保持一致。

      (4)突变体Kex2-K291H和Kex2-K291L的催化效率提高,两者的Kcat/Km值分别为天然Kex2蛋白酶的1.85倍和2.05倍。

(7)  表(2) 参考文献 (15)

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