棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus），由国药集团威奇达药业有限公司提供。

种子培养基主要成分为甘油、豆饼粉、糊精，pH7.0，121 ℃灭菌30 min。

摇瓶发酵培养基主要成分：黄豆饼粉、甘油、淀粉、吗啉丙磺酸（MOPS）、三油酸甘油酯、K₂HPO₄、微量元素（NaCl 0.100，MgCl₂ 0.100，CaCl₂·2H₂O 0.100，FeCl₃ 0.030，CuCl₂ 0.005，MnSO₄ 0.005，ZnCl₂ 0.005，ZnSO₄ 0.065，g/L）；调节pH到6.9，121 ℃灭菌30 min。

摇瓶种子培养：将解冻后的孢子悬液0.5 mL接于100 mL种子培养基中，28 ℃恒温培养72 h，摇床转速为160±10 r/min。

摇瓶发酵培养：将0.25 mL种子液接于发酵培养基中，25 ℃恒温培养168 h，摇床转速为160±10 r/min。

摇床：旋转振荡摇床，型号SPH-322D，摆振幅度Φ100 mm，上海世平实验设备有限公司。

显微镜：Olympus BX-53，显微成像系统Cellsens。

本研究中使用的三角摇瓶全容积3L，博美玻璃仪器厂购入，带有一个挡板的摇瓶如图2所示。

图  2  带一个挡板3L摇瓶

Figure 2.  3L Flask with one baffle

摇瓶在摇床上的运动是一种绕转动轴转动的特殊公转，并且转动过程中瓶身前后左右各面的方位不变（设前后左右表面分别对应南北西东这四个方位，在公转过程中这几个方位保持不变）。在CFD模型中对此运动进行模拟不能通过简单的绕轴运动进行模拟，因为瓶体中不同位置的流体微团在同一时刻受到的转动离心力也是不同的，需要对其进行建模。

以上运动可以看成是摇瓶不动，而摇瓶内的发酵液流体微元均受到重力及绕该流体微元周期性运动的离心力的共同作用。基于此，可通过以下模型对每个流体微元进行受力分析如下：

如图3所示，摇瓶中发酵液流体微元各自绕其固定的轴作旋转运动，旋转角速度为$ \omega $，旋转半径为r，流体微元同时受到离心力$ {f}_{c} $及重力$ {f}_{g} $的作用，并且满足：

图  3  摇瓶运动过程中药瓶内发酵液流体微元受力分析

Figure 3.  Analysis of the fluid micro-element force in the fermentation liquid of the medicine bottle during shake flask movement

$ {f}_{c} $可进一步分解为x，y两个方向的分力，

这样摇瓶内流体共受到三个方向的质量力的作用，相应的加速度为：

摇瓶中气液氧传递速率能力通过$ {k}_{L}a $表征，$ {k}_{L}a $越大传质能力越强，反之传质能力越弱。$ {k}_{L}a $可以拆为两部分进行模拟，即表征液膜传质阻力的液膜传质系数$ {k}_{L} $，以及表征传质交界面面积大小的气液比表面积$ a $。

用于描述气液交界面液膜传质系数的方法有Higbie的渗透理论^[16]，表面更新理论等^[17]。本文采用Higbie的渗透理论进行$ {k}_{L} $的建模。模型如下：

其中：$ {D}_{L} $为氧在发酵液中的扩散系数，$ \varepsilon $为能量耗散率，$ \mu $为发酵液黏度，$ \rho $为发酵液密度。

对于比表面积的计算采用下式：

其中：$ A $为摇瓶中形成的气液交界面的面积，可直接由模拟获取。$ {V}_{L} $为摇瓶中发酵液的体积。

采用Euler-Euler法对摇瓶内的气液两相流动进行建模，气相和液相均作为连续相处理，初始时刻按装液量确定气液交界面位置对流场进行初始化，此交界面以下为液体，交界面以上为气体。摇瓶内气液两相流动形成的自由表面通过VOF方法进行追踪。

摇瓶内流体网格生成采用Ansys ICEM CFD进行，利用四面体网格进行划分，最大网格尺寸小于5 mm，不带挡板摇瓶中共生成40万网格，带挡板摇瓶生成60万网格。

流场建模及数值模拟再Ansys CFX12.0中进行，湍流模型选用$ k-\mathrm{\varepsilon } $双方程模型。

摇床的运动是振荡（Shaking）而不是旋转（Rotation），其工作原理如图4所示。因此，对其上安装的摇瓶内流体的运动的模拟不能采用简单的绕轴旋转进行建模，应该在考虑摇瓶绕轴1的公转外，同时考虑摇瓶绕自身轴心轴2的反向自转。本文中为探究可用于模拟摇瓶中流体流动的真实模型，分别比较了单纯绕轴1的公转的模拟结果，以及利用方法部分1.5中讨论的模型算法进行模拟摇瓶的运动。

图  4  摇床运动原理示意图

Figure 4.  Schematic diagram of shaker movement principle

模拟结果显示，采用单纯绕轴1的旋转模型无法真实模拟发酵液在摇瓶内的真实运动，形成一个相对稳定的倾斜方向朝向旋转轴的自由表面，这种流动状态下不存在流体微元间的相对运动，从而混合和相间传质较小，完全不符合真实摇瓶中的发酵液流动^[18-19]。真实情况下，摇瓶在运动过程中，摇瓶在绕摇床旋转中心轴运动的同时以相同大小的角速度逆向自旋，从而保持前后左右各面保持方位不变。利用文中提出的旋转离心加速度的方法对摇瓶中的模拟结果与实际情况相符，如图5所示。

图  5  利用本文提出的旋转离心加速度模型模拟得到的不同时刻形成的气液流动自由表面（80 r/min）

Figure 5.  The gas-liquid flow free surface (80 r/min), which is formed at different times, is simulated by the rotational centrifugal acceleration model proposed in this paper

通过计算流体力学模拟，比较了3L带档板与不带挡板摇瓶中形成的流场。重点考察了不同搅拌转速对摇瓶中形成的气液交界面大小、比气液交界面大小、平均液膜传质系数、以及平均体积氧传递系数的大小（图6）。从结果来看，在较低转速（40 r/min）下，挡板结构对形成的气液接触面、液膜传质系数及平均体积氧传递系数均无显著影响。而随着转速的增加（80~160 r/min），同转速下形成的气液交界面面积在有挡板的情况下明显大于无挡板摇瓶。而在液膜传质系数大小上，挡板的作用则更加复杂，随着转速的增加不带挡板的液膜传质系数先增加后降低，80 r/min转速下不带挡板摇瓶中液膜传质系数明显优于带挡板摇瓶。而转速再增加，挡板对液膜传质系数的提升作用明显，120 r/min和160 r/min都表现出更高的k_L值。综合来看，转速对平均k_La的影响，带档板摇瓶内k_La随转速增加的幅度明显要大于不带挡板摇瓶，并且转速越高越明显。

图  6  不同转速下带档板与不带挡板摇瓶中传质参数流场预测值对比（装液量680 mL）

Figure 6.  Comparison of flow field prediction values of mass transfer parameters between shaker flask with and without baffle at different speeds (liquid volume 680 mL)

通过进一步深入比较不同转速下形成的药瓶内的流场结构，尤其是气液交界自由表面，可以更直观地比较挡板结构对摇瓶中流场结构的影响，从而显示两种结构的摇瓶在同样转速操作下的流场差异。图7比较了不同转速下带档板和不带挡板摇瓶内形成的气液两相流动中的气液交界自由表面。图中采用相同颜色标尺来表示流场中k_La的大小分布,红色表示k_La最大值，蓝色表示k_La最小值，其他颜色表示k_La介于两者之间。从图7可以直观地看出，同样转速下挡板摇瓶中形成的自由表面具有更多褶皱，而不带挡板摇瓶形成的自由表面则更加光滑，这就是导致两者形成的气液交界面面积在挡板摇瓶中形成的更大的原因^[20]。

图  7  不同转速下带档板和不带挡板摇瓶形成的气液自由表面对比

Figure 7.  Comparison of gas-liquid free surface formed by shaking flask with and without baffle at different rotating speed

模拟结果显示，最大k_La往往分布在气液自由表面沿旋转方向的尾部边缘，最小k_La则大多分布在沿旋转方向前沿的内部区域。文献报道^[20]曾经揭示，旋转摇瓶中的气液传质多发生在液体在摇瓶壁面划过后留下形成的薄层液膜中，按此理论气液传质应该在自由表面划过的尾部传质最为剧烈，这与本文的研究结果一致。

通过考察不同转速下摇瓶中平均剪切应变率大小，比较了带档板与不带挡板摇瓶内剪切力大小。结果发现除了较低的40 r/min转速下，两者剪切力相差不大（2%）外，带档板摇瓶比不带档板摇瓶平均高出27%。较高的剪切力一方面促进了气液传质与混合能力，同时也为菌丝体断裂形成更多分支提供了有利条件。后续对两种形式摇瓶中进行的发酵实验菌形分析结果与此一致。

在考察了不同摇床转速及挡板结构对摇瓶内流场参数的影响基础上，进一步在带挡板结构的摇瓶中考察了装液量对流场参数的影响，结果显示在图8中。从中可见装液量对液膜传质系数的影响较对气液交界面面积的影响明显，随着装液量的增加液膜传质系数增加幅度远大于气液交界面面积增幅。相反，装液量增加比表面积迅速降低。总体效果为，随着装液量增加总的平均单位体积氧传质系数先增大后降低，在所考察的转速下存在最优装液量在650 mL左右。这与发酵实验得到的结果一致。

图  8  带档板摇瓶中不同装液量下流场参数CFD模拟预测值（摇床转速120 r/min）（a）气液交界面面积；（b）气液比表面积；（c）平均液膜传质系数；（d）体积气液传质系数平均值

Figure 8.  CFD simulation prediction value of flow field parameters under different liquid loading in shaking flask with gear plate (rotating speed of shaking table 120 r/min) (a) Gas-liquid interface area; (b) Gas-liquid specific surface area; (c) Average liquid membrane mass transfer coefficient; (d) Volume gas-liquid mass transfer coefficient average

进一步对摇瓶中剪切力的比较发现，摇床转速（120 r/min）不变情况下，装液量多少几乎对平均剪切应变率没有显著影响，形成的平均剪切应变率为41.15 ± 4.36[s⁻¹]。

本实验中通过CFD数值模拟方法，清晰地展现了不同转速、不同装液量对挡板及无挡板摇瓶中形成的流场进行了详细研究。然而在实际摇瓶中培养结果如何，与模拟结果之间是否成对应关系，还不清楚，也无法通过数值模拟的方法获取。因此，为验证CFD模拟结果，在不带挡板摇瓶及带档板摇瓶中分别进行了种子培养过程及发酵培养过程的实验研究。

首先比较了带档板摇瓶及不带挡板摇瓶中克拉维酸生产菌种子培养过程的实验对比，结果如图9所示。图中（b）表明，带档板摇瓶中菌体量明显小于不带挡板摇瓶。该结果验证了同样操作条件下，由于挡板结构的存在流场中形成更大的剪切作用（对照结果2.2部分），从而抑制了细胞的表观比生长速率，形成了相对较低的菌体浓度。培养结束前即使在菌浓相对较低的状态下，带档板摇瓶中美兰褪色时间仍比不带挡板摇瓶短（图9-c），充分说明了带档板摇瓶中更高的气液氧传递能力，从而表现出更高的克拉维酸生产能力，导致更高的发酵液粘度（图9-d）。

图  9  带档板与不带挡板摇瓶中种子培养过程参数变化对比

Figure 9.  Comparison of seed culture parameters in shaking flask with and without baffle

在此基础上，进一步比较了使用两种形式3 L摇瓶，分别培养基装量150、250、500、650、900 mL进行克拉维酸发酵培养，通过显微镜1000X观察过程菌丝生长变化，以菌丝分枝程度、内涵物积累多少作为分化指标，我们发现随着装量的增加，两种摇瓶出现不同程度的供氧不足，菌丝形态出现了显著的差异。带有挡板的摇瓶，前期生长阶段菌丝快速生长并伴随大量分枝，当装量大于650 mL，菌丝有少量结团，而没有挡板的摇瓶，在相同装量的条件下，菌丝分枝细长但分枝数量少，PMV较低，菌丝结团现象普遍，这个差异说明了没有挡板的剪切力，菌丝的快速生长易形成团球，导致氧和营养物质传递至菌团内部，影响菌丝生长代谢。再对比培养后期菌丝变化情况，带有挡板的摇瓶中，菌丝呈现明显次级代谢特征，菌丝分化断裂伴随有大量内含物的积累。整个过程菌丝形态变化，进一步证明了档板结构更容易形成较大剪切，促使培养前期菌丝产生更多分支，加速前期菌丝快速生长，从而有利于培养后期的菌丝分化。

图10显示了两种结构摇瓶中进行克拉维酸发酵的结果，随着发酵液装液量的增加，两种摇瓶表现出明显相反的发酵效价变化趋势。无挡板摇瓶随着装液量的增加，发酵效价呈下降趋势；而带挡板摇瓶正好相反，发酵效价随装液量增加而增加，到装液量650 mL，达到效价最高值，当装液量继续增大对效价不增反降。通过前面流场的分析可以很清晰地找出导致上述差异的原因，即发酵液中的气液氧传递能力的差异主要是两种摇瓶中气液氧传递能力差异引起的。模拟结果也表明，挡板摇瓶平均体积氧传质系数随着装液量增加而增加，到装液量达到650 mL以上时气液氧传质系数不再增加，因而发酵效价不再升高；相反不带挡板摇瓶随着装液量的增加体积氧传递系数明显降低从而发酵效价明显降低。

图  10  带档板与不带挡板摇瓶中装液量对克拉维酸的影响

Figure 10.  Effect of liquid content in shaking flask with and without baffle on clavulanic acid

本文提出了一种用于模拟摇瓶在摇床上运动从而模拟流体流动的计算流体力学模型，采用周期性旋转的旋转加速度来模拟摇瓶运动对其内流体运动的驱动力，从而真实地模拟了流体旋转形成的气液交界的自由表面。

利用形成的模拟摇瓶气液两相流的模型，分别研究了摇床不同转速、摇瓶内发酵液装量大小对摇瓶内形成的流场进行了详细模拟研究，分别考察了以上因素对气液交界面大小、比表面积大小、液膜传质系数、剪切力大小、以及平均氧传质能力的比较。结果表明：装液量不变情况下，平均体积氧传质系数随着转速增加而增大，且加装挡板对传质能力提升明显；形成的剪切力也随着转速增加而增加，且挡板摇瓶明显大于不带挡板摇瓶，这也解释了带档板摇瓶对克拉维酸种子培养和发酵具有促进作用的原因；进一步关于装液量对流场结构的研究表明，转速大小对剪切力的影响远大于装液量的作用，不同装液量下几乎得到相同的剪切力，但是特定转速下存在与之相统一的最优的装液量。

带档板摇瓶中形成的相对高的剪切及相对充足的供氧条件为克拉维酸发酵提供了更好的流场条件，即供给足量的氧气分子参与克拉维酸分子的生物合成，同时也提供了有利于菌丝分支数提高的剪切环境。本文的研究从流场研究的角度揭示了流场结构对于发酵过程的重要影响，从而也提供了一种用于进行摇瓶培养条件优化的数值方法，形成的方法可推广到其他发酵产品。