高级检索

  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
引用本文:
Citation:

南海海绵Pseduoceratina sp.化学成分的细胞毒协同增效作用及靶点预测

    作者简介: 竺婷婷(1992-),女,硕士生,研究方向为天然产物活性成分的分离分析。Email:454122716@qq.com;
    通讯作者: 蓝闽波, minbolan@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: R285

Synergistic Cytotoxicity Effects Study of Chemical Constituents from the South China Sea Sponge Pseduoceratina sp.

    Corresponding author: LAN Min-bo, minbolan@ecust.edu.cn
  • CLC number: R285

  • 摘要: 以肿瘤细胞毒活性筛选为导向,采用硅胶柱色谱及高效液相色谱等现代色谱技术对南海海绵Pseduoceratina sp.化学成分进行分离纯化,并利用电喷雾质谱和核磁共振波谱等波谱技术对化合物进行结构表征;采用磺酰罗丹明B(SRB)法评价组分(成分)对人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2和人宫颈癌细胞HeLa的增殖抑制作用,分析组分和单一化合物的细胞毒活性,探讨可能的联合作用机制;采用Chemmapper Server对化合物进行靶点计算,推测作用靶点。结果表明,从南海海绵Pseduoceratina sp.中分离并鉴定得到hemifistularin-3(1)和11, 19-dideoxyfistularin 3(2)2个溴代酪氨酸类生物碱,2个化合物对三种肿瘤细胞IC50均大于91.76 μmol/L,而以一定配比时IC50可达到8.71 μmol/L,二者对肿瘤细胞的增殖抑制具有明显的协同作用。2个化合物作用靶点可能集中在热休克转录因子1和辣椒素受体1,而协同作用可能跟化合物的多靶标作用相关。
  • 图 1  化合物12的结构式

    Figure 1.  Structures of compounds 1 and 2

    表 1  各组分及化合物对三种肿瘤细胞的IC50值($\bar x \pm s$n=3)

    Table 1.  The IC50 values of different fractions and three compounds against different cell lines($\bar x \pm s$, n=3)

    GroupIC50/(μg·mL−1)
    A549HeLaHepG2
    Fr.172.91 ± 0.0258.82 ± 0.1570.54 ± 0.03
    Fr.219.16 ± 0.049.05 ± 0.0322.24 ± 0.06
    Fr.327.35 ± 0.0116.43 ± 0.0933.43 ± 0.01
    Fr.46.12 ± 0.2013.35 ± 0.0733.10 ± 0.06
    Fr.533.91 ± 0.0120.11 ± 0.1523.00 ± 0.04
    Fr.615.21 ± 0.079.15 ± 0.049.07 ± 0.05
    Compound 193.91 ± 0.0368.23 ± 0.0396.05 ± 0.08
    Compound 299.29 ± 0.06>100>100
    5-FU30.70 ± 0.028.75 ± 0.1346.30 ± 0.07
    下载: 导出CSV

    表 2  化合物12不同配比下对三种肿瘤细胞的IC50值($\bar x \pm s$n=3)

    Table 2.  The IC50 values of mixed compounds 1 and 2 against different cell lines ($\bar x \pm s$, n=3)

    n(Compound 1):
    n(Compound 2)
    IC50 /(μmol·L−1)
    A549HeLaHepG2
    2:1 28.09 ± 0.08 25.20 ± 0.13 30.88 ± 0.02
    1:1 11.41 ± 0.03 11.43 ± 0.09 14.90 ± 0.01
    1:2 8.71 ± 0.06 9.73 ± 0.06 27.55 ± 0.05
    1:3 25.62 ± 0.03 18.10 ± 0.10 38.86 ± 0.09
    1:4 22.05 ± 0.04 13.98 ± 0.14 31.00 ± 0.01
    Compound 1 >100 >100 >100
    Compound 2 91.76 ± 0.06 >100 >100
    下载: 导出CSV

    表 3  化合物12不同配比的CI值

    Table 3.  The CI values of mixed compounds 1 and 2

    n(Compound 1):
    n(Compound 2) mol/mol
    CI
    A549HeLaHepG2
    2:10.3210.2100.279
    1:10.2810.1640.242
    1:20.2740.1580.271
    1:30.3150.1860.298
    1:40.3210.2100.279
    下载: 导出CSV

    表 4  化合物1预测靶标

    Table 4.  Predicted targets of compound 1

    Target NameSpeciesScore
    Vanilloid Receptor 1
    (TRPV1, VR1)
    Rattus norvegicus1.0
    Hsf1 proteinMus musculus0.758
    Vanilloid Receptor 1
    (TRPV1, VR1)
    Homo sapiens0.729
    carboxy-terminal domain
    RNA polymerase II polypeptide A
    small phosphatase 1 isoform 1
    Homo sapiens0.649
    glycogen synthase kinase
    3 beta isoform 1
    Homo sapiens0.66
    HIV-1 IntegraseHuman mmunodeficiency virus 10.604
    Histamine H3 ReceptorHomo sapiens0.584
    Metabotropic
    glutamate receptor 1
    Rattus norvegicus0.538
    Beta-2 adrenergic receptorHomo sapiens0.509
    LANAHuman herpesvirus 80.447
    下载: 导出CSV

    表 5  化合物2预测靶标

    Table 5.  Predicted targets of compound 2

    Target NameSpeciesScore
    Vanilloid Receptor 1 (TRPV1, VR1)Homo sapiens1.0
    Histamine H3 ReceptorHomo sapiens0.772
    Hsf1 proteinMus musculus0.701
    Platelet activating factor receptorHomo sapiens0.563
    Adenosine A1 receptorRattus norvegicus0.486
    Thromboxane-A synthaseHomo sapiens0.473
    GABA receptor alpha-1/ alpha-2/ alpha-3/ alpha-4/beta-1/gamma-2 subunitBos Taurus0.394
    Epoxide hydrataseHomo sapiens0.356
    Phosphoglycerate kinase 1/2Homo sapiens0.343
    streptokinase A precursorStreptococcus pyogenes M1 GAS0.329
    下载: 导出CSV
  • [1] WU Q H, NAY B, YANG M, et al. Marine sponges of the genus Stelletta as promising drug sources: chemical and biological aspects[J]. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2019, 9(2): 237-257. doi: 10.1016/j.apsb.2018.10.003
    [2] 黄新苹. 四种海洋生物的化学成分及其生物活性研究[D]. 山东青岛: 中国科学院海洋研究所, 2006.
    [3] KALAITZIS J A, LEONE P A, HOOPER J N A, et al. Ianthesine E, a new bromotyrosine-derived metabolite from the Great Barrier Reef sponge Pseudoceratina sp.[J]. Natural Product Research, 2008, 22(14): 1263-1269.
    [4] SALIM A A, KHALIL Z G, CAPON R J. Structural and stereochemical investigations into bromotyrosine-derived metabolites from southern Australian marine sponges, Pseudoceratina app.[J]. Tetrahedron, 2012, 68(47): 9802-9807. doi: 10.1016/j.tet.2012.09.008
    [5] THIRIONET I, DALOZE D, BRAEKMAN J C, et al. 5-Bromoverongamine, a novel antifouling tyrosine alkaloid from the sponge Pseudoceratina sp[J]. Natural Product Letters, 1998, 3: 209-214.
    [6] LEBOUVIER N, JULLIAN V, DESVIGNES I, et al. Antiplasmodial activities of homogentisic acid derivative protein kinase inhibitors isolated from a Vanuatu marine sponge Pseudoceratina sp.[J]. Marine Drugs, 2009, 7(‏ 4): 640-653.
    [7] KON Y, KUBOTA T, SHIBAZAKI A, et al. Ceratinadins A-C, new bromotyrosine alkaloids from an Okinawan marine sponge Pseudoceratina sp.[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2010, 20(15): 4569-4572.
    [8] HUANG X P, DENG Z W, VAN SOEST R W M, et al. Brominated derivatives from the Chinese sponge Pseudoceratina sp.[J]. Journal of Asian Natural Products Research, 2008, 10(3): 239-242. doi: 10.1080/10286020701604862
    [9] CHEN C L, KAO Y C, YANG P H, et al. A small dibromotyrosine derivative purified from Pseudoceratina sp. suppresses TGF- responsiveness by inhibiting TGF-type I receptor serine/threonine kinase activity[J]. Journal of Cellular Biochemistry, 2016, 117(12): ‏ 2800-2814. doi: 10.1002/jcb.25581
    [10] GONG J, CAI C, LIU X, et al. ChemMapper: A versatile web server for exploring pharmacology and chemical structure association based on molecular 3D similarity method[J]. Bioinformatics, 2013, 29(14): 1827-1829. doi: 10.1093/bioinformatics/btt270
    [11] LU W, LIU X, CAO X, et al. SHAFTS: A hybrid approach for 3D molecular similarity calculation. 2. Prospective case study in the discovery of diverse p90 ribosomal S6 protein kinase 2 inhibitors to suppress cell migration[J]. Journal of medicinal chemistry, 2011, 54(10): 3564-3574. doi: 10.1021/jm200139j
    [12] HU K, WANG M M, ZHAO Y, et al. A small-scale medication of leflunomide as a treatment of COVID-19 in an open-label blank-controlled clinical trial[J]. Virologica Sinica, 2020. doi: 10.1007/s12250-020-00258-7
    [13] NGO T N, NGUYEN N D P, NGUYEN N T L, et al. Markhasphingolipid A, new phytosphingolipid from the leaves of Markhamia stipulata var. canaense V. S. Dang.[J]. Natural Product Research, 2020, 34(13): 1820-1826. doi: 10.1080/14786419.2018.1561686
    [14] MANCINI I, GUELLA G, LABOUTE P, et al. Hemifistularin 3: A degraded peptide or biogenetic precursor? Isolation from a sponge of the order verongida from the coral sea or generation from base treatment of 11-oxofistularin 3[J]. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1, 1993, 25(24): 3121-3125.
    [15] KUBO H, MATSUI K, SAITOH T, et al. Synthesis and assignment of the absolute stereochemistry of (+)-hemifistularin 3[J]. Tetrahedron, 2015, 46(6): 6392-6397.
    [16] KERNAN M R, CAMBIE R C, BERGQUIST P R. Chemistry of Sponges, VII. 11, 19-Dideoxyfistularin 3 and 11-Hydroxyaerothionin, Bromotyrosine Derivatives from Pseudoceratina durissima[J]. Journal of Natural Products, 1990, 53(3): 615-622. doi: 10.1021/np50069a012
    [17] LING A, SUN L W, GUO W B, et al. Individual and combined cytotoxic effects of T-2 toxin and its four metabolites on porcine Leydig cells[J]. Food and Chemical Toxicology, 2020, 139: 111277. doi: 10.1016/j.fct.2020.111277
    [18] DAVIS J B, GRAY J, GUNTHORPE M J, et al. Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia[J]. Nature, 2000, 405(6783): 183-187. doi: 10.1038/35012076
    [19] MERGLER S, SKRZYPSKI M, SASSEK M, et al. Thermo-sensitive transient receptor potential vanilloid channel-1 regulates intracellular calcium and triggers chromogranin A secretion in pancreatic neuroendocrine BON-1 tumor cells[J]. Cellular Signalling, 2012, 24(1): 233-246. doi: 10.1016/j.cellsig.2011.09.005
    [20] 吴谓, 刘飞飞, 刘颖, 等. 靶向HSF1 在肿瘤治疗中的作用[J]. 医学分子生物学杂志, 2016, 13(1): 52-58. doi: 10.3870/j.issn.1672-8009.2016.01.010
    [21] BATISTA D, COSTA R, CARVALHO A P, et al. Environmental conditions affect activity and associated microorganisms of marine sponges[J]. Marine Environmental Research, 2018, 142: 59-68. doi: 10.1016/j.marenvres.2018.09.020
    [22] AMOODIZAJ F F, BAGHAEIFAR S, TAHERI E, et al. Enhanced anticancer potency of doxorubicin in combination with curcumin in gastric adenocarcinoma[J]. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology, 2020, 34(6): e22486.
    [23] SATAPATHY S R, SJOLANDER, A. Cysteinyl leukotriene receptor 1 promotes 5-fluorouracil resistance and resistance-derived stemness in colon cancer cells[J]. Cancer Letters, 2020, 488: 50-62. doi: 10.1016/j.canlet.2020.05.023
    [24] CONTASSOT E, TENAN M, SCHNURIGER V, et al. Arachidonyl ethanolamide induces apoptosis of uterine cervix cancer cells via aberrantly expressed vanilloid receptor-1[J]. Gynecologic Oncology, 2004, 93: 182-188. doi: 10.1016/j.ygyno.2003.12.040
    [25] REILLY C A, TAYLOR J L, LANZA D L, et al. Capsaicinoids cause inflammation and epithelial cell death through activation of vanilloid receptors[J]. Toxicological Sciences, 2003, 73(1): 170-181. doi: 10.1093/toxsci/kfg044
    [26] LIANG W J, LIAO Y, ZEMING LI, et al. MicroRNA-644a promotes apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by downregulating the expression of heat shock factor 1[J]. Cell Communication and Signaling, 2018, 16: 30. doi: 10.1186/s12964-018-0244-z
    [27] YUN H H, BAEK J Y, SEO G, et al. Effect of BIS depletion on HSF1-dependent transcriptional activation in A549 non-small cell lung cancer cells[J]. Korean Journal of Physiology and Pharmacology, 2018, 22(4): 457-465. doi: 10.4196/kjpp.2018.22.4.457
    [28] HUA L D, WANG J, CHEN X J, et al. Lanosterol modulates proteostasis via dissolving cytosolic sequestosomes/aggresome-like induced structures[J]. BBA - Molecular Cell Research, 2020, 1867: 118617.
  • 加载中
图(1)表(5)
计量
  • 文章访问数:  287
  • HTML全文浏览量:  183
  • PDF下载量:  1
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2020-08-28
  • 网络出版日期:  2020-12-16

南海海绵Pseduoceratina sp.化学成分的细胞毒协同增效作用及靶点预测

    作者简介:竺婷婷(1992-),女,硕士生,研究方向为天然产物活性成分的分离分析。Email:454122716@qq.com
    通讯作者: 蓝闽波, minbolan@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学 化学与分子工程学院,上海市功能性材料化学重点实验室,上海 200237

摘要: 以肿瘤细胞毒活性筛选为导向,采用硅胶柱色谱及高效液相色谱等现代色谱技术对南海海绵Pseduoceratina sp.化学成分进行分离纯化,并利用电喷雾质谱和核磁共振波谱等波谱技术对化合物进行结构表征;采用磺酰罗丹明B(SRB)法评价组分(成分)对人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2和人宫颈癌细胞HeLa的增殖抑制作用,分析组分和单一化合物的细胞毒活性,探讨可能的联合作用机制;采用Chemmapper Server对化合物进行靶点计算,推测作用靶点。结果表明,从南海海绵Pseduoceratina sp.中分离并鉴定得到hemifistularin-3(1)和11, 19-dideoxyfistularin 3(2)2个溴代酪氨酸类生物碱,2个化合物对三种肿瘤细胞IC50均大于91.76 μmol/L,而以一定配比时IC50可达到8.71 μmol/L,二者对肿瘤细胞的增殖抑制具有明显的协同作用。2个化合物作用靶点可能集中在热休克转录因子1和辣椒素受体1,而协同作用可能跟化合物的多靶标作用相关。

English Abstract

  • 海绵占海洋生物物种的6.7%,其结构独特、活性优异的次级代谢产物[1]是海洋药物先导物的重要来源之一。海绵Pseudoceratina sp.属于Verongida目Aplysinellidae Bergquist科[2],广泛地分布在澳大利亚大堡礁[3]和南澳海域[4]、加勒比海[5]、瓦努阿图海[6]、日本冲绳岛[7]及中国南海海域[8-9]。该属海绵的化学成分以溴代衍生物为代表,显示出多种生物活性,如杀疟原虫活性、广谱的抗菌性、抗肿瘤活性,以及作为小分子抑制剂治疗癌症、纤维化和其他疾病等,具有重要研究价值。

    本文的目标是以肿瘤细胞毒活性为导向,在我国南海海绵Pseudoceratina sp.中分离和筛选出具有高活性的组分或成分。在天然产物的药用活性物质发现过程中,除了基础的细胞试验外,当得到某化合物且结构明确,可通过综合评估化合物和靶标的结构的相关性、活性基团等因素,对可能的靶标进行排序,并通过已知的效用筛选相关的靶标,分析并预测可能的靶标,最后进行验证,从而可大大提高活性物质的筛选效率。李洪林等[10]在SHAFTS[11]计算化合物3D分子相似性基础上设计开发了Chemmapper Server,在ChEMBL、DrugBank、BingDB、PDB、KEGG等数据库中寻找与目标化合物3D构型相似的小分子的靶标来预测目标化合物的靶标,并根据随机游走算法对目标化合物与靶标结合度进行排序,通过该算法不仅成功地开发了老药新用,而且筛选出了新型冠状病毒的抗病毒药物用于临床治疗[12]

    因此,本文采用磺酰罗丹明B(SRB)对Pseudoceratina sp.甲醇/二氯甲烷(v/v=1:1,下同)提取物的乙酸乙酯萃取物分离纯化后的部分进行肿瘤细胞毒活性评价,以期得到抗肿瘤活性好的化学成分或组分,并在Chemmapper Server上对所得的化学成分进行靶点计算,推测可能的作用靶点,为抗肿瘤候选药物的开发提供理论和实践依据。

    • Aglient DD2 600 MHz核磁共振仪(美国Aglient公司);Bruker AVANCEⅢ400 MHz核磁共振仪(瑞士Bruker公司);电喷雾—飞行时间质谱仪(美国Waters公司);高效液相色谱仪(Aglient 1260型,Aglient公司);半制备液相色谱仪(UV230Ⅱ紫外—可见检测器,P270 高压恒流泵,大连依利特公司);色谱柱Xcharge C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)、色谱柱C18HCE(10 mm×250 mm×10 μm)(华谱新创科技有限公司);色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm,Aglient公司);电子天平(FA2004型,上海良平仪器仪表有限公司);柱层析硅胶(100 ~ 200目,200 ~ 300目,烟台江友硅胶开发有限公司);Sephadex LH-20 型凝胶(Pharmacia公司);细胞培养箱(BB5060型,美国Thermo Fisher Scientific 公司);洁净工作台(SW-CJ-2FD型,苏净集团苏州富泰空气技术有限公司);多功能酶标仪(SpectraMax M2型,美国Molecular Devices 公司);LOOYE ZX 98-1型旋转蒸发仪(上海鲁伊工贸有限公司);台式低速自动平衡离心机(L-550型,湖南湘仪实验仪器开发有限公司);冷冻干燥机(LGJ-10D型,北京四环科学仪器有限公司)。

    • DMEM高糖培养基、青霉素—链霉素双抗溶液购自HyClone公司;胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶购自Gibco公司;PBS(自配,氯化钾、氯化钠、十二水合磷酸氢二钠,磷酸二氢钾均为分析纯,购自上海凌峰化学试剂有限公司);磺酰罗丹明B(SRB)购自Sigma-Aldrich 试剂公司。

    • 海绵实验样品于2011年8月采自南海西沙海域,经台湾国立中山大学周雅岚鉴定为Pseudoceratina sp.,样品(YT-39)保存于海军军医大学药学院海洋药物研究中心。

    • 细胞株HeLa人宫颈癌细胞,A549人肺癌细胞,HepG2人肝癌细胞,购买自中国科学院细胞库。

    • 称取海绵样品(湿重)550 g粉碎,甲醇与二氯甲烷1 : 1超声提取5次(400 mL,30 min)。合并提取液,减压浓缩得到总浸膏24.3 g。总浸膏用300 mL甲醇水(体积比为1:1)混悬后,依次用石油醚,乙酸乙酯,正丁醇萃取3次(300 mL/次),乙酸乙酯萃取部位浓缩后得浸膏9.29 g,使用硅胶柱色谱分离,石油醚—乙酸乙酯(100:0, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 0:5)梯度洗脱,根据薄层色谱检测,合并相同组分,得6个组分 (Fr.1 ~ Fr.6)。Fr.4 (251 mg)经半制备液相分离得到化合物1(15.2 mg),2(43.2 mg)。

    • 采用SRB法[13]测定体外抗肿瘤增殖活性取对数生长期的肿瘤细胞,胰酶消化后,用含有10% FBS 的DMEM 高糖培养液制成单细胞悬液,以2.5 × 104个/mL,200 μL /孔均匀地种于96孔板中。细胞于5%CO2,37 ℃恒温培养箱中培养24 h贴壁生长后,弃去原上清培养液,加入200 μL带有不同浓度样品的培养液作为实验组,5-氟尿嘧啶(5-FU)为阳性对照,不加样品的空白对照组(培养液为含有10%FBS 的DMEM 高糖培养液),每组设置3个复孔。细胞在培养箱培养48 h后,弃去培养液,每孔加入100 μL含有10%三氯乙酸的培养液(不含FBS的DMEM 高糖培养液),置于4 ℃下固定。1 h后,弃去培养液,用超纯水清洗5次,每孔加入100 μL的含有0.4% SRB溶液染色。20 min后弃去染色液,1% 冰醋酸溶液洗去多余SRB溶液。每孔加入150 μL的10 mmol·L−1unbuffered Trisbase溶解SRB,振荡摇匀后,在540 nm处测定吸光度值A,同时设置空白对照组(完全培养液)、阳性对照组(5-FU),细胞增殖抑制率以下列公式进行计算:

      细胞增殖抑制率=(1−A样品/A空白对照)×100%

      数据结果以平均值±标准偏差表示,绘制化合物浓度—细胞增殖抑制率曲线。采用GraphPad Prism 5软件进行Nonlinear regression拟合分析,计算各样品的半数抑制浓度(IC50)。

    • 在chemmapper(网址 http://lilab.ecust.edu.cn/chemmapper/)中上传化合物1和2的分子构型,采用SHAFTS方法预测具有与化合物12的3D构型相似的化合物的作用靶点,选取BingDB作为筛选数据库,根据化合物的结构将筛选结构相似度的阈值分别定为1.0、0.8,根据所得靶点的功能,作用机制等筛选对细胞增殖、生长、迁移、DNA修复相关的靶点,以及具有相互联系的靶点。

    • 各组分及化合物对三种肿瘤细胞的IC50的结果见表1,由表1结果发现6个分离组分中对肿瘤细胞A549、HeLa和HepG2的细胞毒活性最佳的部位为Fr.6(IC50值均≤15.21 μg/mL),其次为Fr.4(IC50值均≤33.43 μg/mL),两个组分的活性均优于或与阳性对照5-Fu相当。液相图上Fr.4组分只有2个峰,显示基本无其他杂质,因此在该组分中分离得到2个化合物(图1),分别鉴定如下:

      GroupIC50/(μg·mL−1)
      A549HeLaHepG2
      Fr.172.91 ± 0.0258.82 ± 0.1570.54 ± 0.03
      Fr.219.16 ± 0.049.05 ± 0.0322.24 ± 0.06
      Fr.327.35 ± 0.0116.43 ± 0.0933.43 ± 0.01
      Fr.46.12 ± 0.2013.35 ± 0.0733.10 ± 0.06
      Fr.533.91 ± 0.0120.11 ± 0.1523.00 ± 0.04
      Fr.615.21 ± 0.079.15 ± 0.049.07 ± 0.05
      Compound 193.91 ± 0.0368.23 ± 0.0396.05 ± 0.08
      Compound 299.29 ± 0.06>100>100
      5-FU30.70 ± 0.028.75 ± 0.1346.30 ± 0.07

      表 1  各组分及化合物对三种肿瘤细胞的IC50值($\bar x \pm s$n=3)

      Table 1.  The IC50 values of different fractions and three compounds against different cell lines($\bar x \pm s$, n=3)

      图  1  化合物12的结构式

      Figure 1.  Structures of compounds 1 and 2

      化合物1:淡黄色粉末,ESI-MS显示有[M+Na]+峰,m/z 694.8,696.8,698.8,700.8,702.8,离子丰度比为1:4:6:4:1,该化合物有4个溴原子。1H-NMR (600 MHz, acetonitrile-d6δH): 7.41 (2H, s, H-3, H-5), 7.17 (1H, s, NH), 6.40 (1H, s, H-13), 4.70 (1H, dd, J = 7.1, 4,6 Hz, H-7), 4.14 (1H, s, H-17), 3.71 (3H, s, OMe), 3.68 (1H, d, J = 18.9 Hz, H-11), 3.46 (1H, ddd, J = 13.8, 6.2, 4.6 Hz, H-8), 3.39 (1H, dt, J = 13.5, 6.6 Hz, H-8), 3.04 (1H, d, J = 18.3 Hz, H-11); 13C-NMR (150 MHz, acetonitrile-d6δC): 160.5 (C-9), 155.2 (C-10), 150.3 (C-1), 148.9 (C-15), 138.2 (C-4), 132.3 (C-13), 131.0 (C-3, C-5), 122.2 (C-16), 113.6 (C-14), 110.9 (C-2. C-6), 91.4 (C-12), 75.0 (C-17), 71.4 (C-7), 60.6 (OMe), 47.3 (C-8), 39.9 (C-11)。与文献[14-15]对照,鉴定为化合物1为hemifistularin-3。

      化合物2:黄色粉末,ESI-MS 显示有 [M+Na]+峰,m/z 1 098.7,1 100.7,1 102.7,1 104.7,1 106.7,1 108.7,1 110.7,离子丰度比为1:6:15:20:15:6:1,该化合物有6个溴原子。1H-NMR (600 MHz, acetonitrile-d6δH): 7.46 (2H, s, H-15和H-17), 7.27 (1H, t, J = 6.0 Hz, NH), 7.13 (1H, t, J = 6.2 Hz, NH), 6.40 (1H,s, H-5), 6.39 (1H, s, H-5’), 4.14 (1H, s, H-1), 4.13 (1H, s, H-1’), 4.04 (2H, t, J = 6.0 Hz, H-12), 3.71 (6H, s, 3-OMe and 3’-OMe), 3.65-3.72 (2H, m, H-7 and H-7’), 3.54 (2H, q, J = 6.6 Hz, H-10), 3.46 (2H, q, J = 6.7 Hz, H-20), 3.06 (1H, d, J = 18.4 Hz, H-7 or H-7’), 3.03 (1H, d, J = 18.4 Hz, H-7 or H-7’), 2.74-2.79 (2H, m, H-19), 2.06 (2H, p, J = 6.5 Hz, H-11); 13C NMR (150 MHz, acetonitrile-d6,δC): 160.1 (C-9和C-9’), 155.4 (C-8 or C-8’), 155.3 (C-8 or C-8’), 152.2 (C-13), 148.9 (C-3和C-3’), 139.7(C-16), 134.3 (C-15和C-17), 132.4 (C-5), 132.3 (C-5’), 122.1和122.0 (C-2和C-2’), 118.5 (C-14和C-18), 113.6 (C-4和C-4’), 91.8和91.7(C-6和C-6’), 75.0 (C-1和C-1’), 72.3 (C-12), 60.6 (3-OMe和3’-OMe), 40.8 (C-20), 40.0 (C-7和C-7’), 37.5 (C-10), 34.7 (C-19), 30.3(C-11)。与文献[16]对照,经鉴定化合物2为11,19-dideoxyfistularin 3。

      细胞毒活性评价表明来源于组分Fr.4的化合物12的活性远低于组分的活性(表1),考虑两者可能存在协同增效作用。

    • 化合物1和化合物2复配后对三种肿瘤细胞增殖抑制能力均高于化合物1和化合物2单独作用的能力(表2),且随着化合物2比重的增加,复配物对三种肿瘤细胞增殖抑制活性均表现为先增强后减弱,化合物以1:2进行配比时,对A549细胞增殖抑制最强,IC50值最低可达到8.71 μmol/L,说明化合物1和化合物2之间存在协同作用,且与化合物之间的比例存在联系。

      n(Compound 1):
      n(Compound 2)
      IC50 /(μmol·L−1)
      A549HeLaHepG2
      2:1 28.09 ± 0.08 25.20 ± 0.13 30.88 ± 0.02
      1:1 11.41 ± 0.03 11.43 ± 0.09 14.90 ± 0.01
      1:2 8.71 ± 0.06 9.73 ± 0.06 27.55 ± 0.05
      1:3 25.62 ± 0.03 18.10 ± 0.10 38.86 ± 0.09
      1:4 22.05 ± 0.04 13.98 ± 0.14 31.00 ± 0.01
      Compound 1 >100 >100 >100
      Compound 2 91.76 ± 0.06 >100 >100

      表 2  化合物12不同配比下对三种肿瘤细胞的IC50值($\bar x \pm s$n=3)

      Table 2.  The IC50 values of mixed compounds 1 and 2 against different cell lines ($\bar x \pm s$, n=3)

      药物对50%用药者起效的剂量(IC50)为有效剂量,两种作用效果方向相同的药物D1和D2有效剂量分别为Z1和Z2,共同作用时实际使用剂量Z1*和Z2*,定义$\dfrac{Z1*}{Z1}+\dfrac{Z2*}{Z2}$为联用指数(CI),CI<1说明两种药物存在协同作用,CI=1说明两种药物为加和作用,CI>1说明则两种药物为拮抗作用[17]。如表3中计算得到的CI值可发现,在化合物以5种配比进行混合后,所有的CI值均小于1,在比例为1:1或1:2时,CI值达到最小,协同效果最佳。其中,两化合物复配对HeLa细胞的协同效果最好,1:2比例下CI值最低可达到0.158,对于A549细胞及HepG2细胞的CI值最低在0.27左右。

      n(Compound 1):
      n(Compound 2) mol/mol
      CI
      A549HeLaHepG2
      2:10.3210.2100.279
      1:10.2810.1640.242
      1:20.2740.1580.271
      1:30.3150.1860.298
      1:40.3210.2100.279

      表 3  化合物12不同配比的CI值

      Table 3.  The CI values of mixed compounds 1 and 2

    • 化合物1及化合物2的结构相似,预测的靶标有相同但排序有所不同。表4表5分别列举了化合物12得分前十的靶标,其中靶标Vanilloid Receptor 1 (TRPV1, VR1)(Homo sapiens)和Hsf1 protein(Mus musculus)排名均在前三。Vanilloid Receptor 1 (TRPV1, VR1)—辣椒素受体1,主要与抗炎、镇痛,神经[18]相关的作用,在被激活时具有抑制肿瘤增殖的作用[19];Hsf1 protein是热休克转录因子(heat shock factors, HSFs)最主要的一种,由于其在转移的肿瘤组织中呈现出高表达,因而不仅可作为癌症诊断预后指标,还可以直接作为肿瘤治疗靶点[20]。基于多靶标的两种化合物联合使用,可能是其显著抑制肿瘤细胞增殖的作用机制。

      Target NameSpeciesScore
      Vanilloid Receptor 1
      (TRPV1, VR1)
      Rattus norvegicus1.0
      Hsf1 proteinMus musculus0.758
      Vanilloid Receptor 1
      (TRPV1, VR1)
      Homo sapiens0.729
      carboxy-terminal domain
      RNA polymerase II polypeptide A
      small phosphatase 1 isoform 1
      Homo sapiens0.649
      glycogen synthase kinase
      3 beta isoform 1
      Homo sapiens0.66
      HIV-1 IntegraseHuman mmunodeficiency virus 10.604
      Histamine H3 ReceptorHomo sapiens0.584
      Metabotropic
      glutamate receptor 1
      Rattus norvegicus0.538
      Beta-2 adrenergic receptorHomo sapiens0.509
      LANAHuman herpesvirus 80.447

      表 4  化合物1预测靶标

      Table 4.  Predicted targets of compound 1

      Target NameSpeciesScore
      Vanilloid Receptor 1 (TRPV1, VR1)Homo sapiens1.0
      Histamine H3 ReceptorHomo sapiens0.772
      Hsf1 proteinMus musculus0.701
      Platelet activating factor receptorHomo sapiens0.563
      Adenosine A1 receptorRattus norvegicus0.486
      Thromboxane-A synthaseHomo sapiens0.473
      GABA receptor alpha-1/ alpha-2/ alpha-3/ alpha-4/beta-1/gamma-2 subunitBos Taurus0.394
      Epoxide hydrataseHomo sapiens0.356
      Phosphoglycerate kinase 1/2Homo sapiens0.343
      streptokinase A precursorStreptococcus pyogenes M1 GAS0.329

      表 5  化合物2预测靶标

      Table 5.  Predicted targets of compound 2

    • 我国南海海域海绵资源丰富且气候地理条件独特,海绵次级代谢产物的多样性很大程度上源于其生长环境的影响[21],对我国南海海域的海绵Pseudoceratina sp.的进行抗肿瘤成分研究,发现潜在生物医药活性物质,将对海绵资源的开发和利用具有重要价值。在活性导向的分离过程中,得到的化合物12的肿瘤细胞抑制活性远低于其上一级组分Fr.4,进一步研究发现两者对抑制肿瘤细胞生长具有协同增效作用。药物的协同作用受到医药工作者的广泛关注,特别在化疗药的减毒增效[22]和抗耐药性[23]方面的研究较多,但作用机理尚不清晰,而在同一来源的化合物间配伍的协同增效则研究更少。

      许多生物活性成分会比其相应的萃取物活性弱,原因可能是分离过程中高活性物质的丢失,本研究从组分Fr.4液相图谱(数据未给出)上可知其基本只含有化合物12,由此排除了高活性物质丢失的可能,抗肿瘤活性增强的原因为协同作用机制所致。

      协同增效的作用可能是共存成分对活性成分的助溶、助转运等作用从而提高活性成分的效用[17],然后本研究中化合物12的抗肿瘤活性均不高,两者之间没有一个核心的高活性成分,由此排除由于化合物的增溶引起的增效作用。

      在化合物12的靶标预测中,根据靶标的功能筛选出与肿瘤细胞增殖、凋亡相关的靶点,比较突出的两个靶标1)Vanilloid Receptor 1,表示化合物可能作为Vanilloid Receptor 1激动剂激活辣椒素受体而具有抗肿瘤作用。Vanilloid Receptor 1在HeLa细胞中高表达[24],且在A549细胞中比HepG2细胞表达多[25]表2中可以看出化合物1和2联合使用时,对HepG2细胞株的细胞毒相对最小。2)Hsf1 protein,表明化合物可作为Hsf1抑制剂,通过抑制Hsf1使得变性蛋白增多诱发肿瘤细胞发生凋亡;研究表明,Hsf1抑制剂也可以与其他药物联用以增加药物对癌细胞的杀伤性[20],这与本研究中两个化合物协同增效作用结果相一致。Hsf1在恶性肿瘤中基本都是高表达,HepG2[26], A549[27], HeLa[28]细胞株经常被用于研究与Hsf1有关的工作,因此两化合物联合增效作用在三种细胞株均有表现。

      本研究通过化合物12的协同作用机制以及预测的靶标,未来的工作将通过靶点Hsf1等验证实验来研究和探索抗肿瘤增效作用机制。本研究为海绵提取物的分离、活性研究和应用模式提供新的思路,从而更精准地在海洋资源中发现和开发候选药物。

(1)  表(5) 参考文献 (28)

目录

    /

    返回文章