高级检索

  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
引用本文:
Citation:

重组大肠杆菌表达豹蛙酶发酵培养基和发酵条件的优化

    作者简介: 夏祯(1987),女,辽宁抚顺人,硕士生,研究方向为重组蛋白药物;
    通讯作者: 王学东, xdwang@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: Q815

Optimization of Fermentation Medium and Conditions for Recombinant E. coli Expressing Onconase

    Corresponding author: WANG Xuedong, xdwang@ecust.edu.cn
  • CLC number: Q815

  • 摘要: 采用Plackett-Burman(PB)实验设计,考察了培养基各组份对重组大肠杆菌表达豹蛙酶的影响,优化了重组大肠杆菌表达豹蛙酶的发酵培养基,并进一步优化了诱导表达条件。在此基础上,采用指数补料和pH-Stat方式在7L发酵罐上进一步验证优化结果。最终结果:摇瓶水平豹蛙酶表达量由培养基优化前9%提高到优化后36%,OD值由4.8提升到5.47。7 L发酵罐上重组菌豹蛙酶表达水平优化后可达到55%,OD600的值优化后可达到35。
  • 图 1  诱导温度对重组菌生长以及表达ONC的影响

    Figure 1.  effect of induction temperature on the growth and expression of ONC of recombinant E. coli

    图 2  诱导浓度对重组菌生长以及表达ONC的影响

    Figure 2.  effect of induction concentration on the growth and expression of ONC of recombinant E. coli

    图 3  诱导前培养时间对重组菌生长以及表达ONC的影响

    Figure 3.  effect of culture time before induction on the growth and expression of ONC of recombinant E. coli

    图 4  摇瓶水平上优化前后重组菌表达ONC情况

    Figure 4.  expression of ONC in recombinant E. coli before and after optimization at shake flask level

    图 5  发酵罐水平优化后重组菌表达ONC情况

    Figure 5.  expression of ONC by recombinant E.coli after optimization of fermentor

    表 1  Plackeet-Burman实验设计因素水平表

    Table 1.  Levels of selected factors for Plackeet-Burman design

    FactorNameMass concentration/(g·L−1)
    Low level(−1)High level(+1)
    AGlucose0.51
    BYeast extract34
    CTryptone1015
    DKH2PO42.654
    ENaCl1015
    FVirtual variable
    GZn2+0.30.4
    HCa2+0.50.7
    I(NH4)2SO456.5
    JMn2+0.150.2
    KFe3+0.30.375
    LCo2+0.070.0875
    MMg2+45
    NVirtual variable
    下载: 导出CSV

    表 2  Plackeet-Burman实验设计及结果

    Table 2.  Plackeet-Burman design matrix with OD600, expression level and OD600×level of expression

    RunVariablesOD600Expression level/%OD600 × Expression level
    ABCDEFGHIJKLMN
    11−111−1−1−1−11−11−1115.1632.6168.053
    211−111−1−1−1−11−11−115.4736.05197.194
    3−111−11−1−1−1−11−11−114.833158.4
    4−1−111−111−1−1−1−11−114.5242.85193.682
    51−1−111−111−1−1−1−11−13.78534.95132.286
    611−1−111−111−1−1−1−114.43536.7162.765
    7111−1−111−111−1−1−1−15.47529.25160.144
    81111−1−111−111−1−1−15.8629.05170.233
    9−11111−1−111−111−1−15.0429146.144
    101−11111−1−111−111−14.5737.9170.233
    11−11−11111−1−111−1114.25536.45146.160
    121−11−11111−1−111−115.11528.65173.203
    13−11−11−11111−1−111−14.7133.05155.666
    14−1−11−11−11111−1−1114.2336.8155.664
    15−1−1−11−11−11111−1−114.4138.95171.769
    16−1−1−1−11−11−11111−1−14.0433.05133.522
    171−1−1−1−11−11−11111−14.8139.85191.679
    1811−1−1−1−11−11−111114.21537.1156.376
    19−111−1−1−1−11−11−11114.59533.15152.324
    20−1−1−1−1−1−1−11−1−1−1−1−1−14.39534.75152.726
    下载: 导出CSV

    表 3  Plackett-Burman实验回归分析结果

    Table 3.  ANOVA of Plackett-Burman design

    FactorAbbrevOD600Expression lerelOD600 × Expression lerel
    FProb>FFProb>FFProb>F
    AGlucose18.090.023833.600.0044226.840.0006
    BYeast extract411.40.000376.890.0009246.460.0006
    CTryptone314.740.000441.290.0030502.470.0002
    DKH2PO4104.120.002059.200.0015609.570.0001
    ENaCl4.140.13476.140.0684895.99<0.0001
    FVirtual variable
    GZn2+3.730.148914.150.01971121.79<0.0001
    HCa2+71.950.00346.280.0664673.430.0001
    I(NH4)2SO4110.090.000829.130.0055345.750.0003
    JMn2+193.870.00039.690.0358939.01<0.0001
    KFe3+361.490.000523.130.0086342.700.0003
    LCo2+280.980.154714.680.0186190.710.0008
    MMg2+3.580.002720.380.0107949.33<0.0001
    NVirtual variable
    ModelR2=99.72%R2(adj)=98.43%R2=97.92%R2(adj)=91.16%R2=99.91%R2(adj)=99.51%
    Prob>F=0.0021Prob>F=0.0098Prob>F=0.0004
    下载: 导出CSV
  • [1] RAINERI A, PRODOMINI S, FASOLI S, et al. Influence of onconase in the therapeutic potential of PARP inhibitors in A375 malignant melanoma cells[J]. Biochemical Pharmacology, 2019, 167: 173-181. doi: 10.1016/j.bcp.2019.06.006
    [2] TAGHIZADEGAN N, FIROZRAI M, NASSIRI M, et al. Use of molecular dynamic tools in engineering of onconase enzyme to increase cellular uptake and evade RI[J]. International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 2020, 26: 737-743.
    [3] 田雪, 王庆诚, 沈如凌, 等. Onconase研究与开发的最新进展[J]. 中国细胞生物学报, 2010(6): 927-934.
    [4] 何庆, 刘志敏. 豹蛙酶研究进展[J]. 生物技术通讯, 2008, 19(5): 760-762. doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2008.05.036
    [5] 董安康. 核糖核酸酶A超家族及其生物学活性[J]. 吉林化工学院学报, 2014, 31(7): 8-11. doi: 10.3969/j.issn.1007-2853.2014.07.003
    [6] 汪楠, 唐小军, 熊四平, 等. 重组豹蛙酶的制备及其生物学特性分析[J]. 南京医科大学学报(自然科学版), 2013, 33(8): 1034-1038.
    [7] 许晓亚, 靳伟, 杨刚刚, 等. 重组豹蛙抗瘤酶促进大鼠肝癌RH-35细胞凋亡[J]. 基础医学与临床, 2016, 36(1): 1-5.
    [8] 鲁艳平, 杨刚刚, 张瑞刚, 等. 豹蛙酶的抗肿瘤作用研究进展[J]. 解剖学报, 2012, 43(4): 574-578. doi: 10.3969/j.issn.0529-1356.2012.04.025
    [9] 赵晶, 王泽建, 郭美锦, 等. 重组毕赤酵母发酵表达人乳头瘤病毒病毒样颗粒培养工艺条件的优化[J]. 华东理工大学学报(自然科学版), 2016(42): 180-186.
    [10] 江元翔, 高淑红, 陈长华等. 响应面设计法优化腺苷发酵培养基[J]. 华东理工大学学报(自然科学版), 2005(03): 309-313. doi: 10.3969/j.issn.1006-3080.2005.03.009
    [11] LIU R S, TANG Y J. Tuber melanosporum fermentation medium optimization by Plackett-Burman design coupled with Draper-Lin small composite design and desirability function[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(9): 3139-3146. doi: 10.1016/j.biortech.2009.12.022
    [12] 李志华. 基于PB试验和响应面分析法对谷氨酸棒杆菌CN1021发酵培养基优化[J]. 中国酿造, 2014, 33(2): 23-27. doi: 10.3969/j.issn.0254-5071.2014.02.006
    [13] 袁玉华, 毕昌昊, 李菊, 等. HIV-1gp41不同片段表达对E. coli细胞毒性作用分析[J]. 科学通报, 2004, 49(2): 173-176. doi: 10.3321/j.issn:0023-074X.2004.02.012
    [14] 张来颖, 陈劲春. 豹蛙酶的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达[J]. 北京化工大学学报(自然科学版), 20, 37(3): 102-105.
    [15] 尉文, 张梦雪, 王学东. 无机氮源在枯草芽孢杆菌补料分批发酵核黄素中的作用[J]. 华东理工大学学报(自然科学版), 2020, 46(04): 543-548.
    [16] SONG H, JIANG J X, WANG X D, et al. High purity recombinant human growth hormone (rhGH) expression in Escherichia coli under phoA promoter[J]. Bioengineered, 2016, 8: 147-153.
    [17] 蒋靖欣, 王学东, 张建国. 发酵工艺对重组人生长激素修饰变体的影响[J]. 重庆理工大学学报(自然科学版), 2010, 24(02): 29-33.
  • 加载中
图(5)表(3)
计量
  • 文章访问数:  751
  • HTML全文浏览量:  360
  • PDF下载量:  5
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2020-08-24
  • 网络出版日期:  2020-10-28

重组大肠杆菌表达豹蛙酶发酵培养基和发酵条件的优化

    作者简介:夏祯(1987),女,辽宁抚顺人,硕士生,研究方向为重组蛋白药物
    通讯作者: 王学东, xdwang@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237

摘要: 采用Plackett-Burman(PB)实验设计,考察了培养基各组份对重组大肠杆菌表达豹蛙酶的影响,优化了重组大肠杆菌表达豹蛙酶的发酵培养基,并进一步优化了诱导表达条件。在此基础上,采用指数补料和pH-Stat方式在7L发酵罐上进一步验证优化结果。最终结果:摇瓶水平豹蛙酶表达量由培养基优化前9%提高到优化后36%,OD值由4.8提升到5.47。7 L发酵罐上重组菌豹蛙酶表达水平优化后可达到55%,OD600的值优化后可达到35。

English Abstract

  • 豹蛙酶(ranpirnase),商品名Onconase(ONC),是全球正在研究的多种药物之一[1-2],最早分离自北极豹蛙(Northern Leopard FrogRana pipiens)的卵母细胞和早期胚胎[3],属于核糖核酸酶A(RNase A)超家族成员,是已知的胰核糖核酸酶超家族成员中最小的单结构域蛋白。它是由104个氨基酸残基组成的一个相对分子质量为11835、等电点为9.7的蛋白质。豹蛙酶能特异性地降解tRNA抑制蛋白质的合成[4],细胞毒性较强, 通过多种机制导致肿瘤细胞凋亡[5]。在体内外对多种肿瘤细胞具有显著杀伤作用[6-7]。临床上作为抗肿瘤药物用于治疗恶性间皮瘤,用于非小细胞肺癌和其他固体肿瘤的治疗也处于临床研究阶段,有着很大的应用前景[8]。为了提高重组蛋白的表达水平,对培养基和表达条件进行优化是一项必须的工作[9]。本实验通过对含有豹蛙酶基因的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)-pET- 22b (+)-ONC进行培养、诱导条件的优化,并且利用Plackett-Burman(PB)实验设计考察多个因素对豹蛙酶表达的影响,从而确定出最优的培养方案,提高豹蛙酶的表达量[10]。 

    • 重组菌:E. coli BL21 (DE3)-pET- 22b (+)-ONC(豹蛙酶的NCBI编号为P22069,基因序列为全基因合成。菌株为本实验室构建保存菌株)。

    • 酵母粉(Yeast Extract):安琪酵母股份公司;蛋白胨(Tryptone):瑞轩生物制品公司;葡萄糖和培养基用无机盐:国药集团化学试剂有限公司;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG):上海国药生物技术有限公司。

    • 种子培养基:LB培养基。发酵培养基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,葡萄糖1 g/L,NaCl 5 g/L,Na2HPO4 1 g/L,KH2PO4 2.65 g/L,MgSO4 2 g/L,pH 7.2;培养基115 ℃灭菌30 min。补料培养基:葡萄糖640 g/L;蛋白胨78 g/L,酵母粉10.78 g/L;115 ℃ 灭菌30 min。

    • 将重组菌E. coli BL21 (DE3)-pET-22b (+)-ONC接入4 mL的LB培养基中(含100 μg/mL的氨苄青霉素),37 ℃摇床培养8 h活化种子。将活化后的种子液按2.5%的接种量接种到发酵培养基中(含100 μg/mL的氨苄青霉素),37 ℃、200 r/min摇床培养一定时间后加入一定浓度的IPTG进行诱导表达,继续培养8 ~10 h。

    • 应用单因素实验考察诱导剂浓度、诱导温度、诱导前培养时间对重组大肠杆菌表达豹蛙酶的影响[11]

    • PB实验是一种两水平部分析因设计,可以利用少量的实验而筛选多个变量。并通过统计分析筛选出众多因素中对实验结果有显著影响的因素,同时也可以在这个过程中不断缩小因素的最优值范围,达到同时粗略优化考察因素的作用[12]

    • 取发酵液4 ℃、10 000 r/min离心20 min收集菌体。弃去上清,沉淀中加入适量缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl 1 mmol/L EDTA,pH 8.0)重悬菌体,4 ℃下超声破壁,然后4 ℃、10 000 r/min离心40 min收集沉淀和上清,分别进行SDS-PAGE分析,通过凝胶扫描成像仪分析电泳结果,得到目的蛋白占总蛋白的比例,即蛋白表达水平。

    • 合适的诱导温度既能保证微生物的正常生长,又能使外源基因得到正确的(可溶性)表达。将重组大肠杆菌置于37 ℃摇床下培养4 h,然后分别加入终浓度0.2 mmol/L IPTG,随后分别置于25~37 ℃之间不同温度摇床中培养10 h,分别取样测定各温度下的菌浓,并按照蛋白表达量测定的方法考察重组大肠杆菌表达豹蛙酶的表达水平。结果发现降低诱导培养温度并不能提高可溶性表达量,蛋白主要以包涵体形式存在。而降低温度不利于重组菌的生长以及豹蛙酶表达(如图1所示),在诱导温度37 ℃时,重组菌表达豹蛙酶的表达水平更高,达到8.3%,而菌体密度也较高,OD600达到了4.8,所以最后决定使用大肠杆菌一般性的最适培养温度37 ℃用于重组菌的后续实验中。

    • 增加诱导剂IPTG浓度可以提高诱导强度,提升蛋白表达水平,但同时对微生物细胞具有一定的毒性[13],因此,合适的添加浓度对重组蛋白表达是非常重要的。将重组大肠杆菌在37 ℃摇床培养4 h,然后分别向摇瓶中添加终浓度为0.1~1.2 mmol/L之间不同浓度的IPTG,并于37 ℃ 继续培养10小时,分别取样测定其菌浓和豹蛙酶的表达水平,结果如图2所示,随着诱导剂浓度的升高,豹蛙酶的表达水平出现先增后减的趋势,而对菌体生长则呈现逐步增加的抑制效果。实验结果表明当IPTG浓度在0.9 mmol/L时表达水平最高,可达到11.6%。但是在此条件下的细胞生长水平则比较差;而在0.2 mmol/L IPTG终浓度的条件下细胞有一个适中的表达水平,同时对细胞生长无明显抑制;从重组菌的生长情况、表达情况与成本方面综合考虑,最终选择0.2 mmol/L为后续实验中IPTG的加入浓度。

      图  1  诱导温度对重组菌生长以及表达ONC的影响

      Figure 1.  effect of induction temperature on the growth and expression of ONC of recombinant E. coli

      图  2  诱导浓度对重组菌生长以及表达ONC的影响

      Figure 2.  effect of induction concentration on the growth and expression of ONC of recombinant E. coli

    • 因为IPTG对菌体生长和蛋白表达有双重影响,所以诱导剂加入的时机是影响总的菌体蛋白表达的重要影响因素。将重组大肠杆菌置于37 ℃摇床下培养不同时间后分别加入终浓度为0.2 mmol/L IPTG诱导剂,继续诱导培养10 h,分别取样测定各实验组的菌浓和豹蛙酶的表达水平。结果如图3所示,随着诱导前培养时间的增加,重组菌表达豹蛙酶的表达水平出现先增后减的趋势,而菌浓则随之有稍许上升。诱导前培养3 h,表达水平最高可达9.4%。这是因为在1~3 h,重组菌进入生长对数期,此时菌体活力较强,所以此时诱导对重组菌表达较好。所以选择3 h作为后续实验的诱导前培养时间。

      图  3  诱导前培养时间对重组菌生长以及表达ONC的影响

      Figure 3.  effect of culture time before induction on the growth and expression of ONC of recombinant E. coli

    • 在上述最适培养和诱导条件下,进一步优化重组大肠杆菌表达豹蛙酶的最优培养基组成,实验采用Plackett-Burman设计方法,筛选对重组大肠杆菌表达豹蛙酶(菌体总密度及豹蛙酶的表达量)影响最为显著的发酵培养基成份因素[14]。采用葡萄糖、甘油、蛋白胨、酵母粉、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4、ZnSO4、CaCl2、(NH4)2SO4、MnSO4、FeCl3、CoCl2、CuSO4、Na2B4O7作为Plackett-Burman实验的研究因素,考察了上述因素对菌体量和豹蛙酶表达水平的影响情况。经过预实验最终从上述因素中选取了12个因素和2个虚拟变量进一步研究考察它们对重组菌表达豹蛙酶的影响(表1),并得到结果(表2)进行后续的数据分析。

      FactorNameMass concentration/(g·L−1)
      Low level(−1)High level(+1)
      AGlucose0.51
      BYeast extract34
      CTryptone1015
      DKH2PO42.654
      ENaCl1015
      FVirtual variable
      GZn2+0.30.4
      HCa2+0.50.7
      I(NH4)2SO456.5
      JMn2+0.150.2
      KFe3+0.30.375
      LCo2+0.070.0875
      MMg2+45
      NVirtual variable

      表 1  Plackeet-Burman实验设计因素水平表

      Table 1.  Levels of selected factors for Plackeet-Burman design

      RunVariablesOD600Expression level/%OD600 × Expression level
      ABCDEFGHIJKLMN
      11−111−1−1−1−11−11−1115.1632.6168.053
      211−111−1−1−1−11−11−115.4736.05197.194
      3−111−11−1−1−1−11−11−114.833158.4
      4−1−111−111−1−1−1−11−114.5242.85193.682
      51−1−111−111−1−1−1−11−13.78534.95132.286
      611−1−111−111−1−1−1−114.43536.7162.765
      7111−1−111−111−1−1−1−15.47529.25160.144
      81111−1−111−111−1−1−15.8629.05170.233
      9−11111−1−111−111−1−15.0429146.144
      101−11111−1−111−111−14.5737.9170.233
      11−11−11111−1−111−1114.25536.45146.160
      121−11−11111−1−111−115.11528.65173.203
      13−11−11−11111−1−111−14.7133.05155.666
      14−1−11−11−11111−1−1114.2336.8155.664
      15−1−1−11−11−11111−1−114.4138.95171.769
      16−1−1−1−11−11−11111−1−14.0433.05133.522
      171−1−1−1−11−11−11111−14.8139.85191.679
      1811−1−1−1−11−11−111114.21537.1156.376
      19−111−1−1−1−11−11−11114.59533.15152.324
      20−1−1−1−1−1−1−11−1−1−1−1−1−14.39534.75152.726

      表 2  Plackeet-Burman实验设计及结果

      Table 2.  Plackeet-Burman design matrix with OD600, expression level and OD600×level of expression

      数据结果采用实验设计软件Design-Expert进行回归方程分析,得到各影响因素的效应值(F值)以及显著性(Prob>F值)(表3)。效应值可以用来反映各个考察因素对于整体的影响。效应值越大则表示该因素对于整体的影响越大,而效应值越接近零则表明该因素对于整体的影响越小。各因素的显著性由Prob>F来决定。当Prob>F小于0.05时表示该因素的效果显著(置信区间选择95%),当Prob>F大于0.1时则表示这个因素的效果不显著。因此,当通过Plackett-Burman实验筛选影响因素时,既要考虑因素的效应值也要考虑因素显著性。

      FactorAbbrevOD600Expression lerelOD600 × Expression lerel
      FProb>FFProb>FFProb>F
      AGlucose18.090.023833.600.0044226.840.0006
      BYeast extract411.40.000376.890.0009246.460.0006
      CTryptone314.740.000441.290.0030502.470.0002
      DKH2PO4104.120.002059.200.0015609.570.0001
      ENaCl4.140.13476.140.0684895.99<0.0001
      FVirtual variable
      GZn2+3.730.148914.150.01971121.79<0.0001
      HCa2+71.950.00346.280.0664673.430.0001
      I(NH4)2SO4110.090.000829.130.0055345.750.0003
      JMn2+193.870.00039.690.0358939.01<0.0001
      KFe3+361.490.000523.130.0086342.700.0003
      LCo2+280.980.154714.680.0186190.710.0008
      MMg2+3.580.002720.380.0107949.33<0.0001
      NVirtual variable
      ModelR2=99.72%R2(adj)=98.43%R2=97.92%R2(adj)=91.16%R2=99.91%R2(adj)=99.51%
      Prob>F=0.0021Prob>F=0.0098Prob>F=0.0004

      表 3  Plackett-Burman实验回归分析结果

      Table 3.  ANOVA of Plackett-Burman design

      根据实验数据分析可知,在实验选取的浓度范围内综合考察后,Zn2+、Mn2+、Mg2+、NaCl、Ca2+、KH2PO4、蛋白胨对重组大肠杆菌表达ONC的总蛋白量有显著影响。通过Plackett-Burman实验确定了影响重组菌表达豹蛙酶的显著因素以及影响因素最适的大致范围,但由于因素之间关联性不强,所以没有再进一步做响应面优化实验,而是综合几次Plackett-Burman实验的结果作为优化好的培养基:蛋白胨10 g/L,酵母粉4 g/L,葡萄糖1 g/L,(NH4)2SO4 5 g/L,NaCl 15 g/L,Na2HPO4 1.6 g/L,KH2PO4 4 g/L,MgSO4 4 g/L,CaCl2 0.5 g/L,MnSO4 0.2 g/L,Fe2(SO4)3 0.3 g/L,ZnSO4 0.3 g/L。

      用上述优化的发酵培养基进行摇瓶实验验证,结果见图4。ONC表达水平由9%提高到36%,OD600值由4.8提升到5.47,从蛋白表达水平和菌体生长情况都得到了改进。

      图  4  摇瓶水平上优化前后重组菌表达ONC情况

      Figure 4.  expression of ONC in recombinant E. coli before and after optimization at shake flask level

    • 为得到大量的重组豹蛙酶,并验证摇瓶水平所得重组菌表达条件的优化结果,在7 L发酵罐上进行了发酵表达试验。使用优化后的发酵培养基和诱导条件,接种量为2%,接种后,根据实际的溶氧变化控制搅拌转速、空气通量使溶氧保持在20%以上,发酵过程中自动调节pH,使其保持在7.0[15]。前期菌体生长阶段采用指数补料方式,补料速率根据菌体的生长状况实时调整,待菌体浓度达到OD600达到20时,加入终浓度0.2 mmol/L IPTG诱导表达,诱导阶段采用pH-stat的控制方式[16-17],再在37 ℃下诱导培养9~10 h,收集发酵液,SDS-PAGE电泳测定ONC的表达量,结果见图5。观察全细胞、细胞破碎上清液、细胞破碎沉淀电泳结果可知,豹蛙酶主要以包涵体形式存在,其中包涵体含量占95%以上。优化后发酵罐上重组菌表达ONC的表达水平可达到55%,摇瓶水平上的优化得到了很好的验证。除表达水平外,重组菌在优化后的发酵培养基中的生长更好,采用分批补料发酵能够获得更高的的菌浓,OD600提高到35,且菌体易于离心、不易自溶,更加稳定。

      图  5  发酵罐水平优化后重组菌表达ONC情况

      Figure 5.  expression of ONC by recombinant E.coli after optimization of fermentor

    • 通过单因素实验对豹蛙酶表达的诱导温度浓度以及诱导前培养时间进行优化,综合实验结果并考虑生产成本最终确定诱导温度为37 ℃,诱导剂浓度为0.2 mmol/L,诱导前培养时间为3 h。通过Plackett-Burman法优化了发酵培养基,在摇瓶水平上豹蛙酶表达量由优化前9%提高到36%,OD600值由4.8提升到5.47。以此为基础,在7 L发酵罐上采用分批补料方式进行重组豹蛙酶发酵表达,表达水平可达到55%,OD600值可达到35。优化结果对重组菌生产豹蛙酶的工业应用有很好的借鉴作用。

(5)  表(3) 参考文献 (17)

目录

    /

    返回文章