-
荧光成像技术已成为具有高空间分辨率的,实时非侵入式生物过程可视化功能的强大工具,可用于癌细胞的早期诊断和治疗等[1-4]。基于分子识别和特定的有机反应原理,研究开发了多种多样的荧光探针,但优异的荧光探针必须满足以下条件:一定的波长范围,荧光发射强度高,生物稳定性好,光稳定性能高,良好的水溶性,出色的灵敏度。广泛使用并具有代表性的荧光探针类别包括有机染料[5-6],生物荧光团[7],量子dots[8]等,而常被用于构建荧光探针的染料包括荧光素,罗丹明,花青,BODIPY,萘酰亚胺等[9]。其中BODIPY是受欢迎的一类荧光团[10],并在生物成像中获得了空前的成功,但其缺点是在特定细胞器中的积累会引起聚集淬灭,水溶性不高。酰亚胺类也是非常常见的功能性良好的荧光探针片段,尤其是萘酰亚胺,富含光物理性质的结构,其吸收和荧光发射光谱位于UV和FL的可见光区域[11-12]。另外,萘酰亚胺易于修饰,可通过理性的结构设计轻松的微调各种光物理性质,生物相容性也高,这也是本文采用基于萘酰亚胺引入萘酸酐基团的着重点。
近几年,在荧光探针分子设计方面,越来越关注于解决水溶性的问题,对于探针用于生物化学研究应用中,特别是细胞成像,良好的水溶性至关重要,有机溶剂会破坏生物分子的正常功能。目前,水溶性差的小分子探针一则是通过包裹在水溶性基质中进行生物应用,或者在分子设计中引入含离子盐侧链或与金属离子配位来提高水溶性,但这增加了制备分离的难度。Xiong等[13]合成了DCF-MPYM染料,该染料引入一个羧酸基团来增加了探针的水溶性,其在应用于细胞成像中是依然被包装在BSA基质中以隔绝氧气,防止荧光淬灭。Zhang等[14]合成了具有AIE功能的TCM系列探针,其设计探针时为了解决探针在亲水性和亲脂性的问题以及防止探针在进入细胞前聚集,添加了TPP基团以增加水溶性,使得探针在细胞应用中有很好的效果。Ni等[15]小组开发了具有典型TADF和结晶诱导的室温磷光(RTP)特征的新型D-A荧光探针PXZT,该分子解决水溶性问题是通过PXZT与锌离子的配位,进而得到水溶性的无荧光分子ZnPXZT1,进入细胞后随着ZnPXZT1的解离释放PXZT及其随后的疏水性聚集以开启聚集诱导的TADF发射,其成像效果良好。至今为了解决探针水溶性的这一难题,通常方法为以上所列举的几类,本文在萘酰亚胺类荧光探针研究的基础上,由受体萘酰亚胺荧光团经过合理的修饰作为提高探针水溶性的基团,这也为设计合成水溶性荧光探针提高了新的思路。
本文基于螺芴骨架通过分子内弱相互作用连接供体和受体设计合成了D-π-A体系,9,9’-螺二芴是一种经典的螺形非共平面分子,中心碳原子通过sp3杂化使得两个芴单元互相垂直,形成十字架结构,提供有效的立体需求。其结构独特性、形态稳定性,光稳定性能被应用于材料的合成,这种刚性结构不仅能够阻止分子之间的团聚,还能有效抑制荧光淬灭。而对于荧光探针在细胞成像中的荧光淬灭,探针分子沉积不易洗去的缺点会得到很好的解决,另外探针分子的受体使用的是萘酰亚胺荧光团,其易于修饰和发光性能好的优点受到很多人的青睐,但纯油性分子的水溶性差,应用于细胞成像前需要被包装在水溶性良好的基质中,增加合成难度。为了解决探针的水溶性问题,通常的方法是在基于萘酰亚胺的荧光团上引入低聚乙二醇、含离子盐的水溶性侧链,而本文提出了新颖的思路,即将萘酰亚胺基团水解得到酸酐,一方面酸酐基团的引入可以使得探针分子在中性和生理酸性溶液中获得足够的水溶性,另一方面基于萘酰亚胺水解得到的酸酐制备合成方法简单,溶于有机相,利于分离纯化。故合成了2,2’-DA结构和2,7-DA结构的三个水溶性探针分子,探针3是2,7-DA结构,探针6和9是2,2’-DA结构,其中探针9是为了使吸收和发射波长更加红移而在探针6的基础上设计合成。探针3,探针6,探针9油溶性良好利于用有机溶剂制备提纯,三个探针的光物理性能显示共轭性3>9>6,随着溶剂碱性的提高,探针的酸酐基团向羧酸/羧酸根形式转变,使其具有良好的水溶性并易于生物应用。细胞成像测试中三个探针染色效果良好,水溶性和生物相容性良好,有望成为癌细胞可视化的强大工具。
-
4,4’-二甲氧基二苯胺、9,9-二己基-2,7-二溴芴购于上海麦克林生化科技公司;氯仿、二氯甲烷、乙酸酐、硝酸、二水合氯化亚锡、乙醚、盐酸、亚硝酸钠、碘化钾、无水乙醇、石油醚、碳酸钾、二氯化钯、四氢呋喃、氯化钠、甲苯、乙腈、乙酸乙酯、乙酸钾、乙酸、硫酸钠、氯化铵、氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇、甲醇、1,4-二氧六环、四氟硼酸三叔丁基鏻、双联频哪醇硼酸酯、9,9’-螺二芴,均购于上海泰坦科技股份有限公司;[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、4-溴-1,8-萘酐、2-乙基己胺,均购于上海阿拉丁试剂股份有限公司;三苯基磷、二甲亚砜购于上海凌峰化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯。
-
核磁共振氢谱(1H-NMR)与核磁共振碳谱(13C-NMR):采用瑞士布鲁克公司的AVANCE Ш400型超导傅里叶变换核磁共振波谱仪(400 MHz)和Ascend 600型的核磁共振波谱仪(600 MHz),在室温下测量,以四甲基硅烷(TMS)为内标,氘代氯仿(CDCl3),氘代二甲亚砜(DMSO-d6)为溶剂。
质谱(MS)采用美国Waters公司生产的的GCTPremier型电子轰击(EI)-高分辨飞行时间质谱仪,测试范围:10~1 500 u,分辨率≥7 000;ESI-高分辨飞行时间质谱仪,型号为Xevo G2 TOF MS,测试范围:50~4 000 u,分辨率≥20 000;飞行时间质谱仪采用新加坡ABS公司生产4800plus,测试范围400~500 000 u。检测样品量大约是5 mg。
紫外-可见光吸收光谱(UV-Vis):采用日本SHIMADZU公司生产的型号为Cary 60的紫外-可见光光度计,样品稀释成1.0
$ \times $ 10-5 mol/L于二甲基亚砜、去离子水、PBS溶液、不同pH缓冲溶液中在比色皿中检测,扫描范围200~800 nm,室温测定。荧光发射光谱:采用HORIBA高灵敏一体式荧光光谱仪,型号为FluoroMax-4,激发波长设为紫外-可见光吸收光谱的最大吸收波长,激发和发射狭缝宽度均设为10 nm,电压设定为530 V,样品稀释成1.0
$ \times $ 10-5 mol/L于二甲基亚砜中检测,室温测定。荧光量子效率的测定采用参比法,标准化合物为罗丹明6G,室温测定。共聚焦成像:采用德国卡尔蔡司生产的Laser scanning Confocal Microscopy (Nikon A1R and TCS SP8),测试时配制探针浓度为1.0
$ \times $ 10-5 mol/L孵育Hela细胞30 min,进行激光扫描测试。 -
Buchwald-Harting(碳氮偶联)的一般反应条件,以化合物5为例,称取4[16](200 mg, 0.27 mmol)/1[16](200 mg,0.28 mmol),4,4'-二甲氧基二苯胺(91.8 mg,0.40 mmol),三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd2(dba)3,19.8 mg,0.02 mmol),四氟硼酸三叔丁基鏻(23.5 mg,0.08 mmol)和叔丁醇钾(49.9 mg,0.45 mmol)于Schlenk管内,抽真空充氮气三次,加入除氧重蒸过的甲苯(10 mL),氮气密封,反应混合物在50 ℃加热30 min,然后120 ℃回流过夜。冷却至室温后,将有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤三次,二氯甲烷萃取三次,然后用无水硫酸钠干燥。真空除去溶剂后,将粗产物通过柱层析纯化,用石油醚和二氯甲烷(体积比9∶1)洗脱,用二氯甲烷和甲醇进行重结晶,得到黄色固体5(120 mg,产率52%)/砖红色固体2(149.3 mg,产率63%)。
-
根据文献方法[17]制备,所得产物核磁数据与文献一致。将4,4’-二甲氧基二苯胺(2.33 mg,10.16 mmol),9,9-二己基-2,7二溴芴(1.0 g,2.03 mmol),叔丁醇钾(360.1 mg,3.25 mmol),四氟硼酸三叔丁基鏻(120.5 mg,0.41 mmol),三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd2(dba)3,99 mg,0.10 mmol)一起加入到烘干的Schlenk管中,抽真空充氮气三次,加入重蒸过的甲苯(50 mL),80 ℃下加热搅拌22 h。然后冷却至室温,用乙酸乙酯萃取三次,饱和氯化钠溶液洗涤三次,取有机相,有机相用无水Na2SO4干燥,减压旋蒸除去溶剂得粗产物。通过柱层析进一步纯化,石油醚和乙酸乙酯(体积比9∶1)作为展开剂,得到黄色固体7-溴-9,9-二己基-N,N-双(4-甲氧基苯基)-9H芴-2-胺(701.2 mg,产率54%)。
称取7-溴-9,9-二己基-N,N-双(4-甲氧基苯基)-9H芴-2-胺(500 mg,0.78 mmol),双联频哪醇硼酸酯(297.4 mg,1.17 mmol),[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(Pd(dppf)Cl2,44 mg,0.114 mmol)和醋酸钾(114.6 mg,1.17 mmol)并加入到烘干的100 mL Schlenk烧瓶中,抽真空充氮气三次,加入10 mL重蒸的1,4-二氧六环,用氮气密封,将反应在70 ℃下搅拌回流12 h。冷却至室温后,用乙酸乙酯萃取三次,用饱和氯化钠溶液洗涤三次,有机相用硫酸钠干燥,并通过旋转蒸发除去溶剂,留下黑色油状物。将该油状物通过柱层析纯化,使用石油醚中增加乙酸乙酯的量的方法淋洗,然后旋干得到黄色油状物,乙醇重结晶,得到黄色固体的7(299.8 mg,产率56%)。
称取化合物7(278.5 mg,0.41 mmol),4(200 mg,0.27 mmol),四三苯基膦钯(5.8 mg,0.01 mmol),碳酸钾(91.2 mg,0.66 mmol)于Schlenk管,抽真空充氮气三次,向反应器中加入四氢呋喃(10 mL)和去离子水(1 mL),用氮气密封,将反应在65 ℃下回流过夜。冷却至室温后,将有机层用盐水洗涤三次,二氯甲烷萃取三次,然后用无水硫酸钠干燥。真空除去溶剂后,将粗产物通过柱层析进一步纯化,使用在石油醚中乙酸乙酯浓度逐渐增加梯度的展开剂,得到黄色固体化合物8(147 mg,产率46%)。
-
参考文献[18]方法并进一步改进,水解反应的一般步骤是:在叔丁醇(10 mL)中加入萘酰亚胺衍生物(0.80 mmol),室温搅拌20 min,再加入氢氧化钾(817 mg,16.0 mmol),在氮气氛围下回流加热3 h,冷却至室温后,加入乙酸(30 mL)。室温再搅拌5小时,析出固体,过滤,柱层析纯化,石油醚和二氯甲烷(体积比2∶1),在二氯甲烷和甲醇中重结晶,得到相应的探针分子3、6、9。基于萘酸酐的三个探针易溶解于有机溶剂,可在有机溶剂中分离纯化,这大大减少了普通水溶性荧光探针制备纯化的难度,这也是为设计合成水溶性荧光探针提供了新的思路。酸酐取代基对水溶液或生理条件下的pH的响应,在中性或弱碱性条件下转化为带电荷的羧酸根基团(图3),将探针分子从油溶性转化为水溶性,方便生物成像应用。
-
通过Buchwald-Harting(碳氮偶联)反应/Suzuki偶联反应和水解反应制备探针3、6、9,其结构经由核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱等谱学技术表征。
化合物2(红色固体,54%):1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 8.54 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 8.49 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 8.09 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.85 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.73 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 7.68 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.56-7.52 (m, 2H), 7.46 (dd, 1H, J = 7.8, 1.0 Hz), 7.33 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 7.16 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 6.90 (d, 7H, J = 8.4 Hz), 6.75 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.69 (d, 4H, J = 8.8 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 4.15~4.05 (m, 2H), 3.74 (s, 6H), 1.94~1.89 (m, 1H), 1.37~1.27 (m, 8H), 0.91 (t, 3H, J = 7.4 Hz), 0.85 (t, 3H, J = 6.8 Hz);13C-NMR (151 MHz, CDCl3, δ) : 164.9, 164.7, 155.8, 150.5, 149.7, 149.3, 148.8, 147.1, 142.4, 141.9, 141.0, 136.9, 134.0, 132.8, 131.3, 130.9, 130.1, 129.9, 128.9, 127.94, 127.91, 127.9, 126.8, 126.2, 125.5, 124.1, 123.0, 121.5, 121.2, 121.0, 120.4, 119.2, 116.8, 114.7, 66.2, 55.6, 44.3, 38.1, 31.0, 28.9, 24.3, 23.3, 14.3, 10.9;MS (EI) calcd. for C59H50N2O4: 850.4 (m/z), found 850.4 (m/z)。
化合物3(红色固体,83%):1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 8.56 (dd, 1H, J = 7.2, 0.4 Hz), 8.51 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 8.20 (dd, 1H, J = 8.6, 0.6 Hz), 7.86 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.74 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.69 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.61~7.57 (m, 2H), 7.45 (dd, 1H, J = 8.0, 1.6 Hz), 7.34 (td, 2H, J = 7.5, 0.7 Hz), 7.17 (td, 2H, J = 7.6 Hz, 0.8 Hz), 6.93~6.89 (m, 7H), 6.75 (d, 1H, J = 0.8 Hz), 6.71~6.67 (m, 4H), 6.47 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 3.74 (s, 6H);13C- NMR (151 MHz, CDCl3, δ):161.0, 160.8, 155.9, 150.6, 149.9, 149.5, 148.8, 148.6, 142.9, 141.9, 140.9, 136.0, 134.4, 133.7, 133.4, 133.1, 131.1, 130.4, 129.8, 128.4, 128.01, 128.0, 127.2, 126.3, 125.4, 124.0, 121.08, 121.06, 120.4, 119.4, 119.0, 117.3, 116.6, 114.7, 66.1, 55.6;MS (EI) calcd. for C51H33NO5: 739.2 (m/z), found 739.2 (m/z)。
化合物5(黄色固体,46%):1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 8.59 (dd, 1H, J = 7.4, 0.6 Hz), 8.56 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 8.14 (dd, 1H, J = 8.4, 0.8 Hz), 7.92 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.85 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.68 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.64 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.59 (dd, 2H, J = 8.0, 1.6 Hz), 7.48 (dd, 1H, J = 8.0, 1.6 Hz), 7.39 (td, 1H, J = 7.5, 0.9 Hz), 7.31 (td, 1H, J = 7.6, 0.8 Hz), 7.19 (td, 1H, J = 7.5, 0.9 Hz), 7.04 (td, 1H, J = 7.6, 0.8 Hz), 7.93 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 6.90-6.85 (m, 6H), 6.73 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.67 (dd, 4H, J = 6.8, 2.4 Hz), 6.54 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 4.18~4.08 (m, 2H), 3.73 (s, 6H), 1.98~1.92 (m, 1H), 1.41~1.29 (m, 8H), 0.93 (t, 3H, J = 7.4 Hz), 0.87 (t, 3H, J = 7.0 Hz); 13C-NMR (151 MHz, CDCl3, δ): 164.9, 164.7, 155.8, 150.5, 149.7, 149.3, 148.8, 147.1, 142.4, 141.9, 141.0, 136.9, 134.0, 132.8, 131.3, 130.9, 130.1, 129.9, 128.9, 127.94, 127.91, 127.9, 126.8, 126.2, 125.5, 124.0, 123.0, 121.5, 121.2, 121.0, 120.4, 119.2, 116.8, 114.7, 66.2, 55.6, 44.3, 38.1, 31.0, 28.9, 24.3, 23.3, 14.3, 10.9;MS (EI) calcd. for C59H50N2O4: 850.4 (m/z), found 850.4 (m/z)。
化合物6(亮黄色固体,73%):1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 8.61 (dd, 1H, J = 7.6, 0.8 Hz), 8.58 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 8.25 (dd, 1H, J = 8.4, 0.8 Hz),7.94 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.85 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.69~7.58 (m, 5H), 7.47 (dd, 1H, J = 8.0, 1.6 Hz),7.40 (td, 1H, J = 7.4, 0.8 Hz),7.31 (td, 1H, J = 7.4, 0.6 Hz), 7.20 (td, 1H, J = 7.6, 0.8 Hz), 7.05 (td, 1H, J = 7.4, 0.8 Hz), 6.94 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 6.91~6.85 (m, 6H), 6.73 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 6.69~6.65 (m, 4H), 6.53 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 3,73 (s, 6H); 13C-NMR (151 MHz, CDCl3, δ):161.0, 160.7, 155.7, 150.2, 149.6, 149.5, 148.8, 148.8, 148.2, 142.8, 141.9, 141.2, 140.8, 137.4, 135.2, 134.2, 133.5, 133.13, 131.10, 130.5, 129.7, 128.7, 128.4, 128.1, 127.4, 126.9, 125.9, 125.4, 124.4, 123.9, 121.8, 120.8, 120.7, 120.5, 119.5, 119.1, 117.6, 117.1, 114.7, 66.2, 55.7;MS (EI) calcd. for C51H33NO5: 739.2 (m/z), found 739.2 (m/z)。
化合物8(黄色固体,52%):1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 8.52 (d, 2H, J = 6.8 Hz), 8.10 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 8.04 (d, 1H, J = 6.4 Hz), 7.97 (d, 1H, J = 6.0 Hz), 7.89 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.84 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.67 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.59 (d, 1H, J = 6.4 Hz), 7.56~7.51 (m, 2H), 7.48~7.37 (m, 5H), 7.34~7.11(m, 4H), 7.05~7.04 (m, 4H), 6.95~6.87(m, 4H), 6.86~6.80 (m, 5H), 4.17~4.03 (m, 2H), 3.79 (s, 6H), 1.92~1.77 (m, 5H), 1.37~1.26 (m, 8H), 1.10~1.00 (m, 12H), 0.92~0.85 (m, 6H), 0.76~0.75 (m, 6H), 0.64~0.60 (m, 4H);13C-NMR (101 MHz, CDCl3, δ): 164.8, 164.7, 155.6, 152.4, 151.3, 149.9, 149.4, 149.1, 149.0, 148.4, 146.8, 142.4, 141.9, 141.7, 141.3, 141.0, 140.8, 138.6, 138.4, 134.2, 132.6, 131.3, 130.9, 130.1, 130.0, 128.9, 128.7, 128.2, 128.0, 127.4, 126.9, 126.0, 124.6, 124.1, 123.0, 122.6, 121.8, 121.2, 120.9, 120.6, 120.3, 119.0, 116.7, 114.8, 66.4, 55.7, 55.2, 44.4, 40.4, 38.1, 31.6, 31.0, 29.8, 28.9, 24.3, 23.9, 23.2, 22.7, 14.3, 14.2, 10.9;MS (ESI) calcd. for C84H82N2O4: 1 182.6 [M]+, found 1 183.6[M+H+]。
化合物9(黄色固体,79%):1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 8.55 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 8.53 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 8.21 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.05 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.97 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.89 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.85 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.69~7.64 (m, 2H), 7.58~7.53 (m, 2H), 7.50~7.32 (m, 6H), 7.23 (t, 1H, J = 7.8 Hz), 7.15 (t, 1H, J = 7.8 Hz), 7.11~7.03 (m, 5H), 6.95~6.88 (m, 4H), 6.84~6.80 (m, 5H), 3.80 (s, 6H), 1.84~1.77 (m, 4H), 1.10~1.00 (m, 12H), 0.77~0.73 (m, 6H), 0.65~0.60 (m, 4H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3, δ): 161.0, 160.7, 155.7, 152.4, 151.4, 150.2, 149.4, 149.0, 148.8, 148.6, 148.4, 142.9, 141.9, 141.7, 141.1, 141.0, 140.9, 138.5, 137.6, 134.3, 134.1, 133.5, 133.1, 131.0, 130.4, 130.0, 128.9, 128.5, 128.32, 128.3, 128.0, 127.4, 127.3, 126.1, 125.8, 124.7, 124.1, 122.5, 121.2, 120.9, 120.71, 120.7, 120.5, 120.4, 120.3, 119.0, 117.6, 116.7, 114.8, 66.4, 55.7, 55.2, 40.4, 31.6, 29.8, 23.9, 22.7, 14.2;MS (Maldi Tof) calcd. for C76H65NO5: 1 071.5 (m/z), found 1 071.5 (m/z)。
-
首先研究了探针分子3、6、9在DMSO稀溶液中酸酐形式下的紫外可见吸收和荧光发射性质,比较3、6、9在二甲基亚砜中的紫外-可见吸收光谱,如图2(a)所示。探针3在351 nm处的强谱带归因于其π-π共轭骨架的吸收,400~500 nm处之间的较长宽吸收带是由于电子给体的4,4'-二甲氧基二苯氨基单元和电子受体的萘酸酐单元之间的分子内电荷转移(ICT)跃迁。基于分子内电荷转移类型的跃迁,其荧光发射性质对溶剂极性非常敏感[16]。因此探针分子6采取了本共轭(HOMO-conjugation)的方式将电子给体和电子受体进行键连,其吸收峰值明显发生蓝移至356 nm,这一吸收带应该是由4,4'-二甲氧基二苯氨基螺芴的π-π*跃迁引起。因此,在探针6的4,4'-二甲氧基二苯氨基和螺芴片段中,插入一个芴的结构,能明显使得这个吸收峰发生红移。探针9的吸收峰值红移至382 nm,更加利于细胞成像中的光激发(激发波长404 nm)。探针分子3、6、9在二甲基亚砜稀溶液中的荧光发射光谱如图2(b)所示,其最大发射峰依次为3 (519 nm),6(440 nm)和9(504 nm),峰值的变化趋势与三个探针分子的紫外-可见吸收光谱相吻合。我们进一步测定并计算了化合物3、6、9的荧光量子产率,分别是0.51,0.07,0.23(表1)。探针分子9是在探针分子6的改进,也有效的增加了发射峰值的位置和荧光量子产率,利于其细胞成像应用。
-
酸酐基团为探针分子在生理条件下的水溶性提供了重要的作用,因为酸酐基团与碱作用转化为羧酸根。为了探索探针分子形态与水溶液酸碱性之间的关系。我们以探针3为例,测试了其不同pH下的紫外-可见吸收光谱(图3(a))。这些吸收光谱在溶液配制之后不随时间变化,说明酸酐基团被碱水解转化反应速率很快,没有动力学迟滞效应。随着溶液碱性不断增加,pH值升高,光谱最大吸收波长处的吸收强度随之增强。将365 nm处的吸光度和472 nm处的吸光度比值(A365/A472)对pH值作图可以发现(图3(b)),比值随pH增大而单调上升。这一现象表明分子中的酸酐官能团逐渐与溶液中氢氧根负离子作用,转变为羧酸/羧酸根结构和双羧酸根结构。由于这种转变探针分子带上了电荷,提高了探针分子在中性或生理酸性下水溶液中溶解的能力。生理条件下(PBS缓冲溶液中,pH约为7.4),溶液呈中性偏弱碱性,此时酸酐基团已经向羧酸根进行转化,使得这类探针分子变得水溶,并可用于生理条件下的细胞成像。
Compound UV-vis absorption Fluorescence emission λmaxDMSO/nm ε(λmaxDMSO)/[105 L·mol−1 cm−1] λemi DMSO/nm λex DMSO/nm Φ 3 441 0.14 519 431 0.51 6 356 0.28 440 346 0.07 9 382 0.53 504 372 0.23 表 1 化合物3、6、9的表征数据
Table 1. Characterization data of compounds 3, 6, 9
图 3 (a)化合物3在不同pH下的紫外-可见吸收曲线;(b)化合物3不同pH下A365/A472的比值;化合物3、6、9(c)在水中(d)在PBS缓冲溶液中的紫外可见-吸收光谱
Figure 3. (a) UV-Vis absorption spectra of compound 3 at different pH; (b)A365 / A472 ratio at different pH of compound 3; Normalized UV-Vis absorption spectrum of compound 3, 6, 9 (c) in water (d) in PBS buffer solution
为了进一步了解三个探针在水中和生理缓冲溶液(pH约为7.4)中的吸收情况,实验制备的探针3、6、9在水中和PBS溶液中的紫外可见吸收光谱归一化处理后如图3(c)和(d)所示。与图2在DMSO中的吸收曲线相比较而言,三个探针的吸收光谱没有明显的变化,这说明三个探针的水溶性皆良好,但三个探针皆有最大吸收波长和起峰红移现象,这是因为溶剂极性增大,使激发态与极性溶剂发生作用,从而降低了能量强度。从图(c)和(d)中可以发现,探针6的水溶性随着碱性的增加而明显增加,这也表明酸酐基团对探针分子水溶性的提高起到了重要作用。
-
为了探索基于三个探针的可视化癌细胞的可行性,进行了Hela细胞成像实验。将Hela细胞与三个探针(10 μmol/L)在37 ℃、CO2/空气(5/95)的条件下孵育30 min,随后用PBS溶液将细胞冲洗3次,进行共聚焦成像实验,其中激发波长λex = 404 nm。如图4所示,三个探针皆成功染色,探针3和9孵育的Hela细胞在绿色通道中显示了较强的荧光,探针6孵育的细胞显示了相对较弱的荧光,三个探针的成像均背景信号干扰小,信噪比高。探针9的荧光强度和成像效果高于探针6,这说明结构的改进达到了良好的效果。三个探针中,探针3的成像效果最好,荧光强度最高,这是因为其的共轭性良好,荧光发射波长最长。总之,细胞成像结果表明设计合成的三个探针均可以作为靶向癌细胞成像的有前途的工具。
-
本文成功设计合成了基于萘酸酐基团以螺芴为骨架的三个水溶性良好的探针3,6,9,这是通过简单有效的化学修饰手段,将普通有机油溶性染料转变成了水溶性良好的探针,为设计合成水溶性荧光探针提供了新思路。通过一系列光物理测试,发现随着溶剂碱性的增加,分子中的酸酐官能团转变为羧酸/羧酸根结构和双羧酸根结构,进一步提高了探针分子在中性或生理酸性下水溶液中溶解的能力,使探针具有了良好的水溶性以利于细胞成像。共聚焦细胞成像中,三个探针皆成功染色,背景信号干扰小,信噪比高,探针3的成像效果最好,荧光强度高,可作为靶向癌细胞成像的有前途的工具。本文的结果对于设计合成基于萘酸酐基团水溶性荧光探针提供了重要的参考意义。
基于萘酸酐的水溶性荧光探针:合成以及在细胞成像中的应用
Naphthalic Anhydride-Based Water-Soluble Fluorescent Probe: Synthesis and Application in Cell Imaging
-
摘要: 荧光探针分子被广泛开发,并在生理环境中进行生物医学应用。应用于生理环境的荧光探针分子需要良好的水溶性,而在有机荧光团上的水溶性基团的引入对探针分子的合成、分离以及提纯都带来了困难。本文设计并合成了以螺芴刚性结构为骨架基于萘酸酐基团的探针分子(3、6和9),将萘酰亚胺荧光团转化为萘酸酐荧光团,利用酸酐基团在碱性条件下的水解反应,转化为带电荷的羧酸根结构进而来提高探针分子的水溶性,同时酸酐基团在有机溶剂中的溶解性利于化合物的分离纯化过程。探针分子随着水溶液pH值增大,其吸收光谱起峰蓝移,溶解性增加,表明探针的萘酸酐基团已经向羧酸根转变,提高了探针的水溶性,以利于细胞成像应用。探针3、6、9在细胞成像中皆成功染色,有效消除了背景信号干扰。说明通过将酰亚胺转化为酸酐基团提高了现有荧光团水溶性的方式,具有开发应用前景。Abstract: Water-soluble fluorescent probes have been developed and applied in physiological environments for biomedical science applications. Such probe molecules require good water-solubility, and the introduction of water-soluble substituents on conventional organic fluorophoreshas brought challenge about the preparation, separation, and purification processes. In this paper, probe molecules (3、6 and 9) based on naphthalene anhydride derived on rigid spiro-bifluorene skeleton were designed and synthesized. By converting commonly used naphthalenedimide functionality to anhydride groups, we were able to hydrolyzethe of acid anhydride groups under alkaline conditions, into a charged carboxylate structure to improve the water solubility of the probe molecule. At the same time, the solubility of the acid anhydride group in common organic solvents facilitates the separation and purification of the compound. UV-vis absorption spectra of a probe molecule in water upon increasing pH value, displayed hyposchromic-shift in absorption and increased solubility, implying the naphthalic anhydride group of the probe has been converted to carboxylate, which makes the probe good water-soluble to facilitate imaging. Probes 3、6、9 were successfully stained in cell imaging, effectively eliminating background signal interference. This result suggested that our strategy is promising for developing water-soluble fluorescent probes.
-
Key words:
- fluorescent probe /
- cell imaging /
- spiro-bifluorene /
- anhydride /
- naphthalimide
-
图 3 (a)化合物3在不同pH下的紫外-可见吸收曲线;(b)化合物3不同pH下A365/A472的比值;化合物3、6、9(c)在水中(d)在PBS缓冲溶液中的紫外可见-吸收光谱
Figure 3. (a) UV-Vis absorption spectra of compound 3 at different pH; (b)A365 / A472 ratio at different pH of compound 3; Normalized UV-Vis absorption spectrum of compound 3, 6, 9 (c) in water (d) in PBS buffer solution
表 1 化合物3、6、9的表征数据
Table 1. Characterization data of compounds 3, 6, 9
Compound UV-vis absorption Fluorescence emission λmaxDMSO/nm ε(λmaxDMSO)/[105 L·mol−1 cm−1] λemi DMSO/nm λex DMSO/nm Φ 3 441 0.14 519 431 0.51 6 356 0.28 440 346 0.07 9 382 0.53 504 372 0.23 -
[1] DEAN K M, PALMER A E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging[J]. Nature Chemical Biology, 2014, 10: 512-523. doi: 10.1038/nchembio.1556 [2] SALIPALLI S, SINGH P K, JURGEN BORLAK. Recent advances in live cell imaging of hepatoma cells[J]. BMC Cell Biology, 2014, 15:26. doi:10.1186/1471-2121-15-26. [3] BAKER M. Cellular imaging: Taking a long, hard look[J]. Nature, 2010, 466(7310): 1137-1140. doi: 10.1038/4661137a [4] GAO M, YU F, LV C, et al. Fluorescent chemical probes for accurate tumor diagnosis and targeting therapy[J]. Chemical Society Reviews, 2017, 46(8): 2237-2271. doi: 10.1039/C6CS00908E [5] LAVIS L D, RAINES R T. Bright ideas for chemical biology[J]. Acs Chemical Biology, 2008, 3(3): 142-155. doi: 10.1021/cb700248m [6] WYSOCKI L M, LAVIS L D. Advances in the chemistry of small molecule fluorescent probes[J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2011, 15(6): 752-759. doi: 10.1016/j.cbpa.2011.10.013 [7] JENSEN ELLEN C. Use of fluorescent probes: Their effect on cell biology and limitations[J]. Anatomical Record Advances in Integrative Anatomy & Evolutionary Biology, 2012, 295(12): 2031-2036. [8] JYOTI K. JAISWAL, SANFORD M. SIMON Potentials and pitfalls of fluorescent quantum dots for biological imaging[J]. Trends in Cell Biology, 2004, 14(9): 497-504. doi: 10.1016/j.tcb.2004.07.012 [9] DUKE R M, VEALE E B, et al. Colorimetric and fluorescent anion sensors: an overview of recent developments in the use of 1, 8-naphthalimide-based chemosensors[J]. Chemical Society Reviews, 2010, 39(10): 3936-3953. doi: 10.1039/b910560n [10] KAURR P, SINGH K. Recent advances in the application of BODIPY in bioimaging and chemosensing[J]. Journal of Materials Chemistry C, 2019, 7(37): 11361-11405. doi: 10.1039/C9TC03719E [11] TINGRASSIA L, LEFRANC F, KISS R, et al. Naphthalimides and azonafides as promising anti-cancer agents[J]. Current Medicinal Chemistry, 2009, 16(10): 1192-1213. doi: 10.2174/092986709787846659 [12] GOSZTOLA D, NIEMCZYK M P, SVEC W, et al. Excited doublet states of electrochemically generated aromatic imide and diimide radical anions[J]. Journal of Physical Chemistry A, 2000, 104(28): 6545-6551. doi: 10.1021/jp000706f [13] XIONG X, SONG F, PENG X J, et al. Thermally activated delayed fluorescence of fluorescein derivative for time-resolved and confocal fluorescence imaging[J]. Journal of the American Chemical Society, 2014, 136(27): 9590-9597. doi: 10.1021/ja502292p [14] ZHANG J, WANG Q, GUO Z, et al. High-fidelity trapping of spatial-temporal mitochondria with rational design of aggregation-induced emission probes[J]. Advanced Functional Materials, 2019, 29(16): 1808153. doi: 10.1002/adfm.201808153 [15] NI F, ZHU Z, TONG X, YANG C L, et al. Organic emitter integrating aggregation-induced delayed fluorescence and room-temperature phosphorescence characteristics, and its application in time-resolved luminescence imaging[J]. Chemical science, 2018, 9: 6150-6155. doi: 10.1039/C8SC01485J [16] 周颖, 晏琦帆. 基于分子内弱相互作用调控热活化延迟荧光的研究[D]. 上海: 华东理工大学, 2018.
[17] LIU Y, MA H, ZHANG L, et al. A small molecule probe reveals declined mitochondrial thioredoxin reductase activity in a Parkinson's disease model[J]. Chemical communications, 2016, 52(11): 2296-2299. doi: 10.1039/C5CC09998F [18] CHEN L, SUN W, LI J, et al. The first ratiometric fluorescent probes for aminopeptidase N cell imaging[J]. Organic & biomolecular chemistry, 2013, 11(2): 378-382. -