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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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不同来源寡聚-1,6-葡糖苷酶异源表达及酶学特性

    作者简介: 华烨(1994—),女,浙江人,硕士生,主要研究方向为分子生物学。E-mail:540798361@qq.com;
    通讯作者: 王永红, yhwang@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: Q71

Heterologous Expression and Enzymatic Properties of Oligo-1,6-Glucosidases from Different Bacteria

    Corresponding author: WANG Yonghong, yhwang@ecust.edu.cn
  • CLC number: Q71

  • 摘要: 寡聚-1,6-葡糖苷酶(EC 3.2.1.10)对于乳酸发酵液残糖中含量较高的异麦芽糖有较高利用活性。基于前期研究工作基础并经BRENDA数据库搜索挑选了5个可能耐温、耐酸的寡聚-1,6-葡糖苷酶基因(凝结芽孢杆菌ATCC 7050 的malL BF29_2011(BC1)和malL BF29_2004(BC2)、枯草芽孢杆菌168的 malL yvdL BSU34560(BS1)和yugT BSU31290(BS2)以及嗜热葡萄糖苷地衣芽孢杆菌KP 1006的malL(KP)),首次利用pET表达系统在大肠杆菌中进行重组表达,纯化及酶学性质的系统研究。结果显示:BC1、BC2、KP的最适pH为5.0,BS1、BS2的最适pH为6.0。最适温度从高到低依次为:KP (60 ℃) > BC1 (56 ℃) = BC2 (56 ℃) > BS1 (43 ℃) = BS2 (43 ℃)。Mg2+${\rm{NH}}_4^ + $对于BC1的酶催化活性具有激活作用,Co2+、K+${\rm{NH}}_4^ + $对于KP有激活作用,但这些离子对于BC2、BS1和BS2都没有明显的激活作用。Zn2+、Cu2+、Ni+对这五种寡聚-1,6-葡糖苷酶都有明显抑制作用。以对硝基苯-α-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物时,酶的转换数和催化效率从高到低依次为:KP > BC1 > BS1 > BS2 > BC2。以乳酸发酵液中的残糖成分作为参考,在以麦芽糖、异麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖以及可溶性直链淀粉作为底物测定酶活时,BC1、BC2、KP、BS1的最适底物都是异麦芽糖,BS2的最适底物为麦芽糖。
  • 图 1  BC1、BC2、KP、BS1、BS2基因PCR(a)和pET-22b(+)双酶切(b)结果

    Figure 1.  Results of PCR amplification of the BC1, BC2, KP, BS1 and BS2 gene (a) and double enzyme digestion of pET-22b(+) (b)

    图 2  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶表达情况及纯化

    Figure 2.  Expression and purification of five oligo-1,6-glucosidases

    图 3  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶的最适pH

    Figure 3.  Optimal pH of five oligo-1,6-glucosidases

    图 4  5种寡聚-1,6-糖苷酶在各自最适pH下的pH稳定性

    Figure 4.  pH stability of five oligo-1,6-glycosidases at their optimal pH

    图 5  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶最适温度

    Figure 5.  Optimum temperature of five oligo-1,6-glucosidases

    图 6  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶在各自最适温度下的热稳定性

    Figure 6.  Thermostability of five oligo-1,6-glucosidases at their optimum temperature

    表 1  不同来源寡聚-1,6-葡糖苷酶基因PCR扩增上下游引物设计

    Table 1.  Primers of different oligo-1,6-glucosidase genes for PCR amplification

    PrimerPrimer base sequence(5’→3’)
    KP(NedI)-FAGATATACATTTGGAAAGAGTATGGTGGAAAG
    KP(HindIII)-RGTGCGGCCGCTGGCAAACGGATTTTATATACG
    BC1(NedI)-FAGATATACAATGACAGAATGGTGGAAAAAAG
    BC1(HindIII)-RGTGCGGCCGCTTTTTCCAGATAGTAAATGGCC
    BC2(NedI)-FAGATATACATTTGCAAGATGCGTGGTGG
    BC2(HindIII)-RGTGCGGCCGCCATTTGTAATAAGACAAAGCATTC
    BS1(NedI)-FAGATATACATATGAGTGAATGGTGGAAAGAAG
    BS1(HindIII)-RGTGCGGCCGCTATACTAATGCCCATCACAGC
    BS2(NedI)-FAGATATACATATGAAAAAGGCTTGGTGGAAG
    BS2(HindIII)-RGTGCGGCCGCGCACCATAGATATATTCTTGCTTC
    YZ-FTGTTTAACTTTAAGAAGGAG
    YZ-RCTCAGTGGTGGTGGTGGTGG
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    表 2  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶的脯氨酸含量与热稳定性

    Table 2.  Proline content and thermostability of five oligo-1,6-glucosidases

    CompoundPro%Topt/℃Relative residual enzyme activity1)/%
    BC14.24563.1±0.9
    BC24.70568.5±1.0
    KP5.586092.2±2.3
    BS14.02437.0±0.7
    BS24.244386.6±3.7
    1) Reaction at optimum temperature for 5 min
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    表 3  离子对5种寡聚-1,6-葡糖苷酶酶活影响

    Table 3.  Effects of ions on enzyme activities of five oligo-1,6-glucosidases

    IonsRelative activity/%
    BC1BC2KPBS1BS2
    Control group100.0±1.87100.0±1.53100.0±2.56100.0±2.45100.0±2.06
    KCl93.17±2.7784.09±4.14114.05±10.3882.14±0.5781.88±5.60
    CaCl2100.30±3.7379.56±1.19107.95±7.8463.06±2.5091.93±0.29
    MgSO4130.38±14.2391.68±5.93102.92±0.3278.82±5.8981.99±9.75
    (NH4)2SO4110.21±6.5386.84±5.16115.83±10.1382.59±3.2184.45±2.60
    ZnSO413.72±2.4815.57±0.2913.90±7.738.20±1.390.68±1.18
    CoCl277.39±6.2481.35±7.97123.13±0.8772.76±8.4568.86±2.76
    NiSO490.57±5.9776.47±9.6179.90±6.4069.64±6.3655.55±1.14
    CuSO40.00±1.121.48±1.4217.32±3.667.13±8.132.18±1.95
    No additional ions were added to the control group, and the final concentration of added ions in each experimental group is 5 mmol/L
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    表 4  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶酶动力学参数

    Table 4.  Enzyme kinetic parameters of five oligo-1,6-glucosidases

    Recombinant
    protein
    Km/
    (mmol·L−1)
    Vmax/
    (mmol·min−1·mL−1)
    Kcat/s−1$\dfrac{{{K_{{\rm{cat}}}}}}{{{K_{\rm{m}}}}} $/
    (s−1·mmol−1·L)
    BC11.770.044 767.012 688.91
    BC21.650.0565.239.59
    KP1.780.025 521.93 095.93
    BS11.410.08934.93663.39
    BS20.970.01151.29156.44
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    表 5  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶底物特异性

    Table 5.  Substrate specificity of five oligo-1,6-glucosidases

    SubstrateEnzyme activity/(mmol·min−1·g−1)
    BC1BC2KPBS1BS2
    pNPG3 385.51±39.2636.57±1.945 657.29±50.64759.58±73.50114.70±7.57
    Maltose0.12±0.110.07±0.010.04±0.040.17±0.014.11±0.04
    Isomaltose12.82±0.080.18±0.047.24±1.351.90±0.11
    Sucrose2.71±0.0450.30±0.020.99±0.01
    Lactose
    Trehalose
    Soluble amylose
    “−” means no measured enzyme activity
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  • 收稿日期:  2020-06-29
  • 网络出版日期:  2020-10-09

不同来源寡聚-1,6-葡糖苷酶异源表达及酶学特性

    作者简介:华烨(1994—),女,浙江人,硕士生,主要研究方向为分子生物学。E-mail:540798361@qq.com
    通讯作者: 王永红, yhwang@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237

摘要: 寡聚-1,6-葡糖苷酶(EC 3.2.1.10)对于乳酸发酵液残糖中含量较高的异麦芽糖有较高利用活性。基于前期研究工作基础并经BRENDA数据库搜索挑选了5个可能耐温、耐酸的寡聚-1,6-葡糖苷酶基因(凝结芽孢杆菌ATCC 7050 的malL BF29_2011(BC1)和malL BF29_2004(BC2)、枯草芽孢杆菌168的 malL yvdL BSU34560(BS1)和yugT BSU31290(BS2)以及嗜热葡萄糖苷地衣芽孢杆菌KP 1006的malL(KP)),首次利用pET表达系统在大肠杆菌中进行重组表达,纯化及酶学性质的系统研究。结果显示:BC1、BC2、KP的最适pH为5.0,BS1、BS2的最适pH为6.0。最适温度从高到低依次为:KP (60 ℃) > BC1 (56 ℃) = BC2 (56 ℃) > BS1 (43 ℃) = BS2 (43 ℃)。Mg2+\begin{document}${\rm{NH}}_4^ + $\end{document}对于BC1的酶催化活性具有激活作用,Co2+、K+\begin{document}${\rm{NH}}_4^ + $\end{document}对于KP有激活作用,但这些离子对于BC2、BS1和BS2都没有明显的激活作用。Zn2+、Cu2+、Ni+对这五种寡聚-1,6-葡糖苷酶都有明显抑制作用。以对硝基苯-α-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物时,酶的转换数和催化效率从高到低依次为:KP > BC1 > BS1 > BS2 > BC2。以乳酸发酵液中的残糖成分作为参考,在以麦芽糖、异麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖以及可溶性直链淀粉作为底物测定酶活时,BC1、BC2、KP、BS1的最适底物都是异麦芽糖,BS2的最适底物为麦芽糖。

English Abstract

  • 凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌,其具有耐高温、耐酸、稳定性好、抗逆性强等优点[1],在工业发酵中主要用来生产L-乳酸。相比于其他生产菌株,凝结芽孢杆菌的发酵温度更高,不易染菌,且发酵工艺较为简单[2],并可以利用一些廉价碳源作为底物原料。但目前在以玉米粉/淀粉水解液为底物的凝结芽孢杆菌产乳酸工业发酵过程中,发酵结束时会有较高浓度的残糖[3],这会使得糖酸转化率下降,并导致乳酸分离纯化过程费用增加、产品质量下降以及货架期缩短。在乳酸发酵液残糖中,异麦芽糖占残糖总量的60%左右,而寡聚-1,6-葡糖苷酶(EC 3.2.1.10)对于异麦芽糖有较高利用活性。

    寡聚-1,6-葡糖苷酶(oligo-1,6-glucosidase,EC 3.2.1.10),也称异麦芽糖酶或糊精6-α-D-葡萄糖水解酶[4-5],是一种外切酶,可以从多糖的非还原性端催化水解α-1,6-糖苷键,如α-极限糊精、异麦芽糖、异麦芽糖酮糖、异麦芽三糖等,同时也能水解对硝基苯-α-D-葡萄糖苷(pNPG)生成葡萄糖苷和对硝基苯酚(pNP)[6]。不同细菌来源的寡聚-1,6-葡糖苷酶的酶学性质有所差异,为了水解凝结芽孢杆菌乳酸发酵残糖液中的异麦芽糖,要求酶具有较好的耐热性和耐酸性。关于酶的热稳定性,Suzuki[4, 7]等提出了脯氨酸法则,在氨基酸序列中脯氨酸含量的增加会使得每个区域结构更加紧密稳定以及疏水性更强,提高蛋白热稳定性。研究人员蛋白中氨基酸残基进行定点诱变为脯氨酸增加了蛋白热稳定性的研究报道,在一定程度上支持了脯氨酸法则,如Matthews等[8]β-转角的丙氨酸定点突变为脯氨酸后提高了噬菌体T4溶菌酶的热稳定性,但需要更多实验依据来验证脯氨酸的普适性。

    基于前期研究工作基础并经BRENDA数据库搜索挑选了5个可能耐温、耐酸的寡聚-1,6-葡糖苷酶基因,分别是B. coagulans ATCC 7050中的malL BF29_2011(BC1)和malL BF29_2004(BC2)、B. subtilis 168中的 malL yvdL BSU34560(BS1)和yugT BSU31290(BS2)以及B. thermoglucosidasius KP 1006中的malL(KP)。其中B. coagulans ATCC 7050适合生长温度为37~50 ℃,BC1和BC2的脯氨酸含量分别为4.32%和4.80%;B. subtilis 168适合生长温度为37 ℃,BS1和BS2的脯氨酸含量分别为4.10%和4.33%,B. thermoglucosidasius KP 1006适合生长温度为55~60 ℃,KP的脯氨酸含量为5.69%。KP的脯氨酸含量最高,其次BC2,BC1、BS2的脯氨酸含量较为接近,BS1的脯氨酸含量最低。

    寡聚-1,6-葡糖苷酶属于α-淀粉酶GH13家族,其结构与其他α-淀粉酶结构相似,其在CSR V的序列是QPDLN[9-10],是能够区分GH13家族中的寡聚-1,6-葡糖苷酶和普鲁兰酶的关键区域[11]。对比BC1、BC2、KP、BS1、BS2在CSR V以及CSR Ⅱ的氨基酸序列,BC2在CSR V的序列是MPDLN,BC2和BS2在CSR Ⅱ的序列中也含有中介酶特异性残基,可推断Bacillus coagulans ATCC 7050的BC2以及Bacillus subtilis 168的BS2基因所表达的酶是中介酶。

    目前研究寡聚-1,6-葡萄糖苷酶,主要将来源于蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌等来源的寡聚-1,6-葡糖苷酶在大肠杆菌[12]、酿酒酵母毕赤酵母中[13]异源表达。寡聚-1,6-葡糖苷酶在大肠杆菌中的表达水平较低,因此蛋白纯化难度较高。随着基因工程的发展,大肠杆菌pET表达系统开始广泛得到应用,它是一种可以使用乳糖或乳糖类似物进行诱导的高效表达系统,同时可以为外源目的基因带上纯化标签进行融合表达,是一种强大有效、应用极广的克隆并表达重组蛋白的系统[14]。其中,pET-22b(+)是大肠杆菌pET表达系统中常用的一种高表达载体,且带有T7启动子、His亲和标签以及多克隆位点,可以在宿主E. coli BL21(DE3)中高效表达不同来源的寡聚-1,6-葡糖苷酶,并满足蛋白纯化和酶活性研究的需求。

    对不同来源的寡聚-1,6-葡糖苷酶进行酶学性质的特性比较研究,可为今后乳酸发酵用凝结芽孢杆菌的基因工程改造和高效菌株融合筛选奠定基础,有效降低乳酸发酵后期的残糖浓度。

    • 凝结芽孢杆菌(B. coagulans)ATCC 7050,大肠杆菌(E. coli)BL21(DE3),大肠杆菌(E. coli)DH5α:均由本实验室保藏;枯草芽孢杆菌(B. subtilis)168:美国ATCC;嗜热葡萄糖苷地衣芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidasius)KP 1006:CGMCC;pET-22b(+):由本实验室保藏;酵母膏、蛋白胨、琼脂:生化试剂,上海凌峰化学试剂;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG):生化试剂,上海碧云天有限公司;pNPG:> 99%,Sigma;限制性内切酶:Takara;细菌基因DNA抽提试剂盒、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒:Axygen;One Step Cloning Kit:Vazyme;PAGE凝胶快速制备试剂盒(10%):雅酶;Ni-NTA 6FF蛋白纯化预装柱(5 mL):上海翊圣生物。

    • 高速冷冻离心机(德国哈默5418):4 ℃离心;超声破碎仪(美国Qsonica Q500):工作时间为10 min,超声3 s,暂停7 s,振幅34%;蛋白电泳槽(BIO-RAD公司165-800):浓缩胶80 V,分离胶120 V;核酸定量仪(Thermo Scientific ND2000/2000c):在280 nm下检测核酸浓度,在205 nm下检测蛋白浓度;96孔酶标仪(Thermo Scientific Varioskan lux):在405 nm下检测对硝基苯酚的浓度。

    • LB液体培养基(g/L)[15]:蛋白胨10,酵母膏5,氯化钠10,pH为7.0。LB固体培养基:在液体培养基基础上再添加18 g/L的琼脂。用于E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3)、B. subtilis 168、B. thermoglucosidasius KP 1006的培养。将LB培养基的pH用盐酸溶液调为5.0,用于B. coagulans ATCC 7050的培养。

    • 培养温度按照B. coagulans ATCC 7050:50 ℃, B. thermoglucosidasius KP 1006:55 ℃,B. subtilis 168、E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3):37 ℃进行培养。首先将冻存于−80 ℃的细菌融化后,在无抗性LB固体平板上划线倒置培养12~14 h,挑取单菌落接种于4 mL液体LB培养基中,220 r/min振荡培养。

    •   (1)提取B. coagulans ATCC 7050、B. subtilis 168、B. thermoglucosidasius KP 1006基因组。将三株菌在LB液体培养基中培养至OD600达到1~2时,取2 mL菌液使用Takara细菌基因组DNA小量纯化试剂盒提取基因组,具体操作按试剂盒内说明书进行。

      (2)PCR扩增目的基因。分别以三株菌的基因组为模板,利用PhantaTM 高保真DNA 聚合酶扩增出BC1、BC2、BS2、BS1和KP五个基因(BC1(NedI)-F/ BC1(HindIII)-R、BC2(NedI)-F/ BC2(HindIII)-R、BS1(NedI)-F/ BS1(HindIII)-R、BS2(NedI)-F/ BS2(HindIII)-R、KP(NedI)-F/ KP(HindIII)-R),引物具体碱基序列见表1。PCR扩增条件:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸1.5 min,进行35个循环;72 ℃彻底延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂凝胶电泳鉴定为目的基因后,使用Axygen胶回收试剂盒进行片段回收。

      PrimerPrimer base sequence(5’→3’)
      KP(NedI)-FAGATATACATTTGGAAAGAGTATGGTGGAAAG
      KP(HindIII)-RGTGCGGCCGCTGGCAAACGGATTTTATATACG
      BC1(NedI)-FAGATATACAATGACAGAATGGTGGAAAAAAG
      BC1(HindIII)-RGTGCGGCCGCTTTTTCCAGATAGTAAATGGCC
      BC2(NedI)-FAGATATACATTTGCAAGATGCGTGGTGG
      BC2(HindIII)-RGTGCGGCCGCCATTTGTAATAAGACAAAGCATTC
      BS1(NedI)-FAGATATACATATGAGTGAATGGTGGAAAGAAG
      BS1(HindIII)-RGTGCGGCCGCTATACTAATGCCCATCACAGC
      BS2(NedI)-FAGATATACATATGAAAAAGGCTTGGTGGAAG
      BS2(HindIII)-RGTGCGGCCGCGCACCATAGATATATTCTTGCTTC
      YZ-FTGTTTAACTTTAAGAAGGAG
      YZ-RCTCAGTGGTGGTGGTGGTGG

      表 1  不同来源寡聚-1,6-葡糖苷酶基因PCR扩增上下游引物设计

      Table 1.  Primers of different oligo-1,6-glucosidase genes for PCR amplification

      (3)构建表达载体。将质粒pET-22b(+)用NedI和HindIII两种限制性酶双酶切,经1%琼脂凝胶电泳鉴定后,使用Axygen胶回收试剂盒进行片段回收。得到目的基因片段和载体酶切片段,使用ClonExpress®试剂盒进行重组连接。挑取阳性转化子送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

    • 经测序验证碱基序列正确的重组质粒热激转化到E. coli BL21(DE3)中获得相应重组菌。挑取单菌落于10 mL含50 μg/mL氨苄LB液体培养基中,37 ℃、220 r/min振荡培养12~14 h至OD600达到4左右时,按照2.5%的接种量接种至LB液体培养基中使得初始OD600为0.1,37 ℃、220 r/min振荡培养。培养1.5 h至OD600达到0.5~0.8,加入IPTG(终浓度为0.3 mmol/L),20 ℃、220 r/min诱导表达重组蛋白。将菌液倒入预冷离心管中取样,8000 g、4 ℃离心收集菌体,用去离子水和1×PBS缓冲液各清洗一次,最后用1×PBS缓冲液重悬菌体,置于冰上进行超声破碎,至液体澄清透明则破碎完全。破碎后样品8000 g、4 ℃离心15 min后分别收集上清和沉淀,上清液为蛋白表达液,沉淀用1×PBS缓冲液重悬,通过SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况。

    • 重组蛋白带有His亲和标签,使用Ni-NTA蛋白纯化预装柱进行纯化。低咪唑上样,再用100、150、200,250 mmol/L咪唑依次梯度洗脱,确定最适浓度咪唑洗脱的方式进行纯化。纯化蛋白经超滤浓缩后经SDS-PAGE分析,并使用核酸定量仪在205 nm处测定蛋白浓度。

    • 通过酶标仪检测对硝基苯-α-D-葡萄糖苷(pNPG)在寡聚-1,6-葡糖苷酶作用下水解生成的对硝基苯酚(pNP)在405 nm下的吸光度来测定寡聚-1,6-葡糖苷酶酶活。实验分为实验组和对照组,每个反应按200 μL体系加样,并做3个平行。实验组先加入131.4 μL 含50 mmol/L pNPG缓冲液,再加入11.5 μL蛋白溶液,在特定温度下孵育一定时间后加入56.1 μL 0.3 mol/L Na2CO3溶液终止反应,测定在405 nm处吸光度。对照组则加入高温灭活后的蛋白溶液。一个酶活单位(1U)定义:在最适条件下,1 min内水解产生1 mmol对硝基苯酚的酶量。

    •   (1)最适pH及pH稳定性。将不同来源寡聚-1,6-葡糖苷酶分别置于不同pH缓冲液配制的pNPG溶液(pH 4.0~6.0,100 mmol/L CH3COOH-CH3COONa缓冲液;pH 6.0~8.0,100 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液;pH 7.0~9.0,50 mmol/L Tris-HCl缓冲液)中检测酶活。并分别置于各自最适pH的缓冲液中,4 ℃静置,在3、6、9、12、15 h取样检测残余酶活。

      (2)最适温度及热稳定性。在各自最适pH下,测定不同来源寡聚-1,6-葡糖苷酶在30~64 ℃的活性。在最适条件下孵育一定时间后,测定在最适条件下的残余酶活。

      (3)离子对酶活影响。参考培养基常用添加成分选取测试离子,检测Ni+,Zn2+,Cu2+,Co2+,Ca2+,Mg2+,K+${\rm{NH}}_4^ + $对于酶活的影响,分别在缓冲体系中添加NiSO4,ZnSO4,CuSO4,CoCl2,CaCl2,MgSO4,KCl,(NH4)2SO4溶液(终浓度为5 mmol/L),以不添加金属离子的体系作为参照,在最适条件下测定酶活。

      (4)测定酶动力学参数。在各自最适条件下,测定其在不同浓度pNPG底物下(0.46,0.92,1.84,2.76,3.68,4.60 mmol/L)产生pNP的速率,利用Microsoft Excel 2016基于Michaelis-Menten公式进行非线性规划求解,得到动力学参数VmaxKm,转换数kcat根据公式kcat=Vmax/[E],催化效率根据kcat/Km计算获得[16]

      (5)分析底物特异性。参考乳酸发酵液中的残糖成分选取测试对象。用缓冲液配制2 g/L的麦芽糖、异麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖以及可溶性直链淀粉的底物溶液,通过检测水解产物葡萄糖的浓度来分析不同来源寡聚-1,6-葡糖苷酶的底物特异性。

    • 以各细菌的基因组为模板,根据基因组序列分别设计相应的引物扩增目的基因。BC1、BC2扩增长度为1 665 bp和1 689 bp,KP扩增长度为1 686 bp,BS1、BS2扩增长度为1 683 bp和1 662 bp。质粒pET-22b(+)经NedI和HindIII限制性内切酶双酶切后得到线性片段,片段长度为5 382 bp。各片段的1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示,长度符合预期。

      图  1  BC1、BC2、KP、BS1、BS2基因PCR(a)和pET-22b(+)双酶切(b)结果

      Figure 1.  Results of PCR amplification of the BC1, BC2, KP, BS1 and BS2 gene (a) and double enzyme digestion of pET-22b(+) (b)

      线性化质粒载体和扩增目的基因片段经一步克隆酶连接后转化至E.coli DH5α中,并涂布于含有氨苄(50 μg/mL)的抗性平板上。挑取转化子菌斑,用pET-22b(+)质粒上选择的克隆位点上下游引物YZ-F/YZ-R进行菌落PCR验证阳性转化子。阳性转化子进一步测序验证,测序序列与插入目的基因序列一致则表明重组质粒构建成功。

    • 图2(f)所示,E. coli BL21(DE3)和含空载质粒pET-22b(+)的菌表达的蛋白大致相同,在IPTG诱导前后总蛋白没有差异,且在66.2 ku大小附近没有明显条带,说明宿主菌本身和含有空载质粒的菌株不表达重组蛋白。

      图  2  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶表达情况及纯化

      Figure 2.  Expression and purification of five oligo-1,6-glucosidases

      将构建好的pET-BC1、pET-BC2、pET-KP、pET-BS1和pET-BS2分别转入到E. coli BL21(DE3)中获得各个转化菌株,并进行IPTG诱导表达。各重组菌在IPTG诱导前和诱导后取样,菌体经超声破碎后获得总蛋白液,离心后获得上清液和沉淀,进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析。

      比较对照组和各重组菌,以及各重组菌IPTG诱导前的菌体总蛋白(见图3(a)~(e) Lane 1)和诱导后的总蛋白(见图3(a)~(e) Lane 2),各重组菌的诱导后总蛋白中含有目的重组蛋白(BC1:66.2 ku;BC2:66.6 ku;KP:67.7 ku;BS1:67.3 ku;BS2:65.3 ku),说明诱导表达成功,且在沉淀和上清液中都存在目的重组蛋白。上清液流经镍柱后,目的重组蛋白亲和吸附于镍柱上,依次用含100、150、200、250 mmol/L咪唑的洗脱液进行洗脱,在含100 mmol/L咪唑的洗脱液中有较多的杂蛋白(见图3(a)~(e) Lane 5),在含150 mmol/L咪唑的洗脱液中得到单一的纯化蛋白(见图3(a)~(e) Lane 6),将用含150 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱并超滤浓缩得到的目的重组蛋白进行酶学特性检测。

      图  3  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶的最适pH

      Figure 3.  Optimal pH of five oligo-1,6-glucosidases

    • 在pH 4.0~9.0范围内,pH-相对酶活曲线如图3所示。当pH=4.0时,5种寡聚-1,6-葡糖苷酶的相对酶活都在20%~30%之间,酶活较低。当pH=5.0时,BC1、BC2、KP的相对酶活为100%,当pH=6.0时,BS1、BS2的相对酶活达到100%。随后随着pH的升高,各个寡聚-1,6-葡糖苷酶的酶活都显著下降。BC1、BC2、KP的最适pH为5.0,BS1、BS2的最适pH为6.0。5种寡聚-1,6-葡糖苷酶在碱性环境下酶活较低,都属于酸性酶。

      值得注意的是,在pH 6.0情况下, BC1、BC2、BS1和BS2在CH3COOH-CH3COONa缓冲液中的相对酶活高于在Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中;在pH 7.0~8.0情况下,5种寡聚-1,6-葡糖苷酶在Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中的相对酶活高于在Tris-HCl缓冲液中。说明Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液较CH3COOH-CH3COONa缓冲液对酶活有一定抑制作用,而Tris-HCl缓冲液较Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液对酶活的抑制作用更强。

      5种寡聚-1,6-葡糖苷酶在各自最适pH下,孵育不同时间测定其pH稳定性,孵育时间-相对残余酶活曲线如图4所示。 KP在孵育3~6 h后相对残余酶活迅速下降至47%,在孵育12 h后相对残余酶活下降至27%。BC1、BC2、BS1、BS2随着孵育时间的延长,酶活缓慢下降,孵育15 h后相对残余酶活分别降至80%、64%、75%、67%,说明这四种酶的pH稳定性高于KP。

      图  4  5种寡聚-1,6-糖苷酶在各自最适pH下的pH稳定性

      Figure 4.  pH stability of five oligo-1,6-glycosidases at their optimal pH

    • 在30~64 ℃温度范围内,温度-相对酶活曲线如图5所示。BC1和BC2从30 ℃开始随着温度升高酶活逐渐增加,56 ℃为最适反应温度达到最高酶活,在60 ℃仍有74%和94%相对酶活。KP从48 ℃提升到52 ℃时相对酶活大幅提升,60 ℃为最适反应温度达到最高酶活,在64 ℃仍有78%相对酶活。BS1、BS2的最适温度均为43 ℃,随着温度升高酶活迅速降低。综上,BC1、BC2、KP为嗜热性酶,BS1、BS2为嗜温性酶。

      图  5  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶最适温度

      Figure 5.  Optimum temperature of five oligo-1,6-glucosidases

      5种寡聚-1,6-葡糖苷酶在各自最适条件下孵育不同时间测定热稳定性,孵育时间-相对残余酶活曲线如图6所示。BS1在43 ℃孵育20 s后相对残余酶活迅速降至50%,酶活在孵育2 min内急速下降。BC1在孵育1 min后相对残余酶活降至50%以下,BC2在孵育1.5 min后降至50%以下。BC1、BC2和BS1在孵育5 min后都几乎失活。相比之下,BS2在0.5 h后相对残余酶活降至35%,孵育2 h后相对残余酶活降至17%。KP在孵育0.5 h后仍有60%以上的相对残余酶活,随后酶活随孵育时间缓慢降低,孵育2 h后相对残余酶活降至31%,表现出较高的热稳定性。

      图  6  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶在各自最适温度下的热稳定性

      Figure 6.  Thermostability of five oligo-1,6-glucosidases at their optimum temperature

      Suzuki等[4]在深入研究比较了来源不同芽孢杆菌的寡聚-1,6-葡糖苷酶的氨基酸组成、结构参数和热稳定性后提出了脯氨酸法则,即增加氨基酸序列中脯氨酸残基的含量可以提高蛋白质的热稳定性。5种寡聚-1,6-葡糖苷酶的脯氨酸含量及热稳定性关系如表2所示。KP的脯氨酸含量最高,其最适温度及热稳定性明显高于其他寡聚-1,6-糖苷酶。BC1、BC2及BS1的脯氨酸含量较低,相应的热稳定性也较低,其中脯氨酸含量最低的BC1的相对酶活衰减速度明显快于其他酶,符合脯氨酸法则对这些酶的热稳定性的预测。

      CompoundPro%Topt/℃Relative residual enzyme activity1)/%
      BC14.24563.1±0.9
      BC24.70568.5±1.0
      KP5.586092.2±2.3
      BS14.02437.0±0.7
      BS24.244386.6±3.7
      1) Reaction at optimum temperature for 5 min

      表 2  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶的脯氨酸含量与热稳定性

      Table 2.  Proline content and thermostability of five oligo-1,6-glucosidases

    • 培养基中常添加的不同离子对酶活影响如表3所示。在此添加浓度下,Mg2+${\rm{NH}}_4^ + $对BC1的酶催化活性具有较明显的激活作用,分别使酶活提高了30%和10%,Mg2+可能是BC1的金属激活剂。Co2+、K+${\rm{NH}}_4^ + $对KP的酶催化活性有明显激活作用,分别使酶活提高了23%、14%和15%。然而这些离子对于BC2、BS1和BS2的酶催化活性没有明显的激活作用。

      IonsRelative activity/%
      BC1BC2KPBS1BS2
      Control group100.0±1.87100.0±1.53100.0±2.56100.0±2.45100.0±2.06
      KCl93.17±2.7784.09±4.14114.05±10.3882.14±0.5781.88±5.60
      CaCl2100.30±3.7379.56±1.19107.95±7.8463.06±2.5091.93±0.29
      MgSO4130.38±14.2391.68±5.93102.92±0.3278.82±5.8981.99±9.75
      (NH4)2SO4110.21±6.5386.84±5.16115.83±10.1382.59±3.2184.45±2.60
      ZnSO413.72±2.4815.57±0.2913.90±7.738.20±1.390.68±1.18
      CoCl277.39±6.2481.35±7.97123.13±0.8772.76±8.4568.86±2.76
      NiSO490.57±5.9776.47±9.6179.90±6.4069.64±6.3655.55±1.14
      CuSO40.00±1.121.48±1.4217.32±3.667.13±8.132.18±1.95
      No additional ions were added to the control group, and the final concentration of added ions in each experimental group is 5 mmol/L

      表 3  离子对5种寡聚-1,6-葡糖苷酶酶活影响

      Table 3.  Effects of ions on enzyme activities of five oligo-1,6-glucosidases

      Zn2+对这5种寡聚-1,6-葡糖苷酶都有强烈的抑制作用,其中使BS2的酶活降低了99.32%。Zn2+被报道对许多酶的活性具有抑制作用[17-19],可能是因为Zn2+易与蛋白酶亲和而改变酶的构象,从而抑制了酶的活性[20]。除Zn2+以外,Ni+也有普遍的抑制作用,其作为重金属离子作用可能与Zn2+相似[21]。Cu2+对5种寡聚-1,6-葡糖苷酶都呈现出强烈的抑制作用,但由于Cu2+在反应体系中产生沉淀会影响酶活的检测,其抑制程度不能精确确定。

    • 在5种寡聚-1,6-葡糖苷酶各自最适条件下,测定其催化水解不同浓度底物pNPG生成pNP的速率,并利用Microsoft Excel 2016基于Michaelis-Menten公式进行非线性规划求解,得到酶学动力参数KmVmax,以及计算得到转换数Kcat和催化效率$\dfrac{{{K_{{\rm{cat}}}}}}{{{K_{\rm{m}}}}}$(见表4)。比较5种寡聚-1,6-葡糖苷酶水解底物pNPG的KmKcat以及$\dfrac{{{K_{{\rm{cat}}}}}}{{{K_{\rm{m}}}}}$,得出对底物pNPG的亲和力从大到小顺序为:BS2 > BS1 > BC2 > BC1 > KP,转化数和催化效率从大到小顺序为:KP > BC1 > BS1 > BS2 > BC2。虽然KP和BC1对pNPG的亲和力较小,但它们有极高的催化效率。Benjamin等[22]汇总了BRENDA数据库中30162种有报道Kcat的酶,KP和BC1的Kcat达到了5 521.90 s−1和4 767.01 s−1,均超过了数据库98%的酶,极高的Kcat表明这两种酶具有很高的应用潜力。

      Recombinant
      protein
      Km/
      (mmol·L−1)
      Vmax/
      (mmol·min−1·mL−1)
      Kcat/s−1$\dfrac{{{K_{{\rm{cat}}}}}}{{{K_{\rm{m}}}}} $/
      (s−1·mmol−1·L)
      BC11.770.044 767.012 688.91
      BC21.650.0565.239.59
      KP1.780.025 521.93 095.93
      BS11.410.08934.93663.39
      BS20.970.01151.29156.44

      表 4  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶酶动力学参数

      Table 4.  Enzyme kinetic parameters of five oligo-1,6-glucosidases

    • 在凝结芽孢杆菌利用玉米粉水解液进行乳酸发酵过程中,发酵后期发酵液中菌体难以利用的残糖主要有异麦芽糖(含α-1,6-糖苷键)、蔗糖(含α-1,2-糖苷键)、麦芽糖(含α-1,4-糖苷键)以及海藻糖(含α-1,1-糖苷键)[3]。因此选取以上发酵液残糖中含量较高的糖类,同时还选取了乳糖(含β-1,6-糖苷键)以及可溶性直链淀粉(含α-1,4-糖苷键)作为底物进行测定分析底物特异性。如表5所示,5种寡聚-1,6-葡糖苷酶对于水解其他底物时的酶活相对于水解pNPG时的酶活较低。BC1、BC2、KP、BS1对异麦芽糖都有水解活性,只有BS2未检测到催化水解异麦芽糖的活性。其中BC1的水解异麦芽糖的活性最高,酶活达到了12.82 mmol/(min·g),其次是KP,酶活达到了7.24 mmol/(min·g)。5种寡聚-1,6-葡糖苷酶中对麦芽糖都有催化水解的活性,其中BS2催化水解麦芽糖的酶活高达4.11 mmol/(min·g)。此外,BC1、KP、BS1还具备一定的催化水解蔗糖的活性。而5种寡聚-1,6-葡糖苷酶都不具备催化水解乳糖、海藻糖及可溶性直链淀粉的活性。

      SubstrateEnzyme activity/(mmol·min−1·g−1)
      BC1BC2KPBS1BS2
      pNPG3 385.51±39.2636.57±1.945 657.29±50.64759.58±73.50114.70±7.57
      Maltose0.12±0.110.07±0.010.04±0.040.17±0.014.11±0.04
      Isomaltose12.82±0.080.18±0.047.24±1.351.90±0.11
      Sucrose2.71±0.0450.30±0.020.99±0.01
      Lactose
      Trehalose
      Soluble amylose
      “−” means no measured enzyme activity

      表 5  5种寡聚-1,6-葡糖苷酶底物特异性

      Table 5.  Substrate specificity of five oligo-1,6-glucosidases

    • (1)首次以pET-22b(+)作为表达载体分别构建了来源于Bacillus coagulans ATCC 7050(BC1、BC2)、Bacillus thermoglucosidasius KP 1006(KP)和Bacillus subtilis 168(BS1、BS2)的5个寡聚-1,6-葡糖苷酶基因的大肠杆菌表达系统,在E. coli BL21(DE3)中诱导表达,并利用镍柱亲和层析方法进行纯化。纯化后5种寡聚-1,6-葡糖苷酶BC1、BC2、KP、BS1、BS2对于水解pNPG的酶活分别达到(3 385.51±39.26) mmol/(min·g)、(36.57±1.94) mmol/ (min·g)、(5 657.29±50.64) mmol/(min·g)、(759.58±73.50) mmol/(min·g)、(114.70±7.57) mmol/(min·g)。

      (2)研究了5种寡聚-1,6-葡糖苷酶的酶学特性。BC1、BC2、KP的最适pH为5.0(CH3COOH-CH3COONa缓冲液),BS1、BS2的最适pH为6.0(CH3COOH-CH3COONa缓冲液)。最适温度从高到低依次为:KP (60 ℃) > BC1 (56 ℃) = BC2 (56 ℃) > BS1 (43 ℃) = BS2 (43 ℃)。Mg2+、NH4+对于BC1的酶催化活性具有激活作用,Co2+、K+、NH4+对于KP的酶催化活性有激活作用,但这些离子对于BC2、BS1和BS2没有明显的激活作用。Zn2+、Cu2、Ni+对这5种寡聚-1,6-葡糖苷酶都有明显抑制作用。比较以pNPG为底物时的KmKcat以及$\dfrac{{{K_{{\rm{cat}}}}}}{{{K_{\rm{m}}}}}$的大小,依据Km判断对底物亲和力:BS2 > BS1 > BC2 > BC1 > KP,而酶的转换数和催化效率从高到低依次为:KP > BC1 > BS1 > BS2 > BC2。在本文所考察的几种底物中,BC1、BC2、KP、BS1的最适底物都是异麦芽糖,BS2的最适底物为麦芽糖。BC1和KP对异麦芽糖的水解活性分别达到了12.82 mmol/(min·g)和7.24 mmol/(min·g),BS2催化水解麦芽糖活力达到了4.11 mmol/(min·g)。此外,BC1、KP、BS1还具备一定的催化水解蔗糖的活性,而5种酶都不具备催化水解乳糖、海藻糖及可溶性直链淀粉的活性。

(6)  表(5) 参考文献 (22)

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