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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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利用CRISPR/Cas9系统构建低DCPC杂质含量的CPC工业高产菌种

    作者简介: 徐 燕(1995—),女,浙江绍兴人,硕士生,主要研究方向:工业微生物基因工程改造。E-mail:yanxu_ecust@163.com;
    通讯作者: 储炬, juchu@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: Q815

Construction of CPC high-yield industrial strain with low DCPC content using CRISPR / Cas9 system

    Corresponding author: CHU Ju, juchu@ecust.edu.cn
  • CLC number: Q815

  • 摘要: 以头孢菌素C(CPC)工业生产菌株顶头孢霉1-D1为研究对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术降低杂质脱乙酰头孢菌素C(DCPC)累积,提高CPC产量与质量。首先,构建了CPC乙酰水解酶敲除菌株Ac-ΔcahB以期减少CPC水解。然后通过导入含cefG基因表达盒的Donor DNA,构建Ac-ΔcahB::cefG菌株以期提高DCPC转化效率。通过摇瓶发酵验证表明Ac-ΔcahB效价未有提高仅杂质含量略有下降,而Ac-ΔcahB::cefG不仅产量比对照提高约32.6%,达6 072 μg/mL,且杂质含量显著降低,为6.81%。从cefG转录水平来看,Ac-ΔcahB::cefG菌株在96 h转录量提高了5倍。可以发现,cefG基因在强启动子PgpdA作用下可提高表达量,促进DCPC转化,从而提高CPC产量。此外,在工业顶头孢霉中,结合Donor DNA共同作用的CRISPR/Cas9系统是一个更为高效的基因编辑方法。
  • 图 1  载体pAN7-cahB构建电泳图。

    Figure 1.  The electrophoretogram of pAN7-cahB construction process. Fig A: cahB-sgRNA fragment (1:84 bp;2:204 bp;3:288 bp); Fig B: pAN7-sorA digested by HindIII and SpeI

    图 2  pAN7-1-cefG构建电泳图。

    Figure 2.  Electrophoresis map of the pAN7-1-cefG construction.

    图 3  Donor DNA构建流程图

    Figure 3.  Donor DNA generation flow chart

    图 4  Donor DNA构建电泳图。

    Figure 4.  Donor DNA construction electrophoretograms.

    图 5  原生质体转化实验流程图

    Figure 5.  The flow chart of protoplast transformation experiment

    图 6  Ac-ΔcahB转化子验证结果。

    Figure 6.  Ac-ΔcahB transformant validation results.

    图 7  Ac-ΔcahB::cefG验证原理图

    Figure 7.  Ac-ΔcahB::cefG verification principle diagram

    图 8  Ac-ΔcahB::cefG PCR验证图。

    Figure 8.  Ac-ΔcahB::cefG PCR verification chart.

    图 9  出发菌株与突变株CPC产量比较。数据代表三个重复试验的平均值和标准偏差。使用单因素方差分析对顶头孢霉1-D1与两个突变株的CPC产量差异进行统计学意义比较(***p <0.001; **p < 0.01; *p < 0.05)。

    Figure 9.  CPC production comparison of starting strain and mutant strain. Data represent the average values and standard deviations from three replicates. Statistical significance was performed using a one-way analysis of variance to compare the CPC concentration differences between A. chrysogenum 1-D1 and each of the two mutants (***p <0.001; **p < 0.01; *p < 0.05).

    图 10  CPC合成与分解相关基因

    Figure 10.  Genes involved in CPC synthesis and decomposition

    图 11  出发菌株与突变株发酵液高效液相色谱图。

    Figure 11.  DCPC content comparison of starting strain and mutant strain. Fig. A: original strain (1-D1); Fig. B: Mutant strain Ac-ΔcahB; Fig. B: Mutant strain ΔcahB::cefG

    图 12  出发菌株与突变株DCPC含量比较。

    Figure 12.  DCPC content comparison of starting strain and mutant strain.

    图 13  DCPC乙酰转移酶基因cefG表达量测定

    Figure 13.  Determination of cefG expression of DCPC acetyltransferase gene

    表 1  引物列表

    Table 1.  List of primers

    Primer nameSequence(5’-3’)
    sgcahB-1aactcaccgcgacgtAAGCTTtgccgc
    CTGATGAGTCCGTGAGGAC
    sgcahB-2catgtggccggtcttgccgc
    GACGAGCTTACTCGTTTC
    sgcahB-3gcggcaagaccggccacatg
    GTTTTAGAGCTAGAAATAGC
    sgcahB-4cagtaacgttaagtg
    ACTAGTTCGAGATGACCCAATGTCC
    R-pAN7-1-FttaatgtgaTAAagtagatgccgaccgcgg
    R-pAN7-1-Rgaggcgacatggtgatgtctgctcaagcgg
    pAN-cefG-Fagacatcaccatgtcgcctcagatcgccaatcgct
    pAN-cefG-Rgcatctacttcacattaatgactgatcgaggaatcc
    cahB-B1-F1gatgccatcacgagatttacgaaga
    cahB-B1-R1acaagggaattcccgtatagtctccgtctccataatc
    cahB-B2-F1ctccactcgaggactctccttattcctgcttacac
    cahB-B2-R1gccacttgattcagtaaccttctatg
    cahB-PT-F1agactatacgggaattcccttgtatctctacacacagg
    cahB-PT-R1tgttagtcaagctgcgatgaagt
    cahB-PT-F2gttgacaaggtcgttgcgtc
    cahB-PT-R2gaataaggagagtcctcgagtggagatgtggagtg
    C-veri-Fcgtcgagtacattgagcaggacgccattgt
    C-veri-Raaaggtttgtggaacacacgccagtgtccc
    C1-1gcagcacctacacctatgatgattctgc
    C1-2ttactggccgttgttgatgagaaggt
    C2-1attggaatgaacatgaatctgaggactgca
    C2-2gcttacctaccgaacatcatctcgaatcgt
    C3-1gggtacatactcatagcaacctacattg
    C3-2tacagagtcgaagaatatcctcttgacacc
    C4-1attaatgcattgactgcaacctagtaacgc
    C4-2gaggttaatctcgataacacacccaacaat
    cefG-F1cacgacgattcgagatgatgtt
    cefG-R1ccgactacggcagcaattt
    *大写字母为模板质粒pUC57中RGR特异性结构的骨架
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-06-23
  • 网络出版日期:  2020-12-16

利用CRISPR/Cas9系统构建低DCPC杂质含量的CPC工业高产菌种

    作者简介:徐 燕(1995—),女,浙江绍兴人,硕士生,主要研究方向:工业微生物基因工程改造。E-mail:yanxu_ecust@163.com
    通讯作者: 储炬, juchu@ecust.edu.cn
  • 1. 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237
  • 2. 国药集团威奇达药业有限公司,山西 037300

摘要: 以头孢菌素C(CPC)工业生产菌株顶头孢霉1-D1为研究对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术降低杂质脱乙酰头孢菌素C(DCPC)累积,提高CPC产量与质量。首先,构建了CPC乙酰水解酶敲除菌株Ac-ΔcahB以期减少CPC水解。然后通过导入含cefG基因表达盒的Donor DNA,构建Ac-ΔcahB::cefG菌株以期提高DCPC转化效率。通过摇瓶发酵验证表明Ac-ΔcahB效价未有提高仅杂质含量略有下降,而Ac-ΔcahB::cefG不仅产量比对照提高约32.6%,达6 072 μg/mL,且杂质含量显著降低,为6.81%。从cefG转录水平来看,Ac-ΔcahB::cefG菌株在96 h转录量提高了5倍。可以发现,cefG基因在强启动子PgpdA作用下可提高表达量,促进DCPC转化,从而提高CPC产量。此外,在工业顶头孢霉中,结合Donor DNA共同作用的CRISPR/Cas9系统是一个更为高效的基因编辑方法。

English Abstract

  • 19世纪50年代,头孢菌素C(CPC)被Abraham和Newton两位学者从顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)培养液中分离鉴定[1-2],随后,以CPC为原料的头孢菌素类抗生素逐渐成为世界抗生素市场的重要一员。该类抗生素属于β-内酰胺类抗生素,具有广谱抗菌性,且相较于青霉素,其疗效更好,安全性高,副作用少。此外,由于CPC中二氢噻嗪环与β-内酰胺环相连的特殊母核结构,使其具有更好的青霉素酶耐受性[3]

    头孢菌素C去除支链后得到的7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是各类头孢菌素衍生药物的起点化合物,常通过发酵手段获得。其中脱乙酰头孢菌素C(DCPC)是发酵生产中一种主要副产物,结构与性质和CPC极为相似,两者均为氨基酸,且常以内铵盐形式存在,发酵生产中含量约为CPC的15%~20%[4]。在现有的生产工艺中,DCPC虽能够与主产物CPC进行分离,但其在余液中的大量残留会造成环境污染。抗生素的长期累积,会使周围土壤微生物与动植物生长进化均会受到影响,长此以往,相关联的上下游生物也会受到干扰,从而影响该地区的生态平衡。虽然目前有许多学者对CPC废液中副产物的再利用进行了大量的研究,但是由于可操作性与经济效益等问题,真正应用于实际生产的还少之又少。

    DCPC的产生积累有两方面原因:一方面,顶头孢霉自身DCPC乙酰转移酶(DCPC-AT)启动子强度不足,转录量低,使DCPC无法有效转化为CPC,成为生产过程中的限制性步骤之一[5];另一方面,顶头孢霉Ⅷ染色体上含有CPC乙酰水解酶基因(cahB),菌体经72 h培养后可编码表达一个1.4 Kb的单链转录子,翻译出的乙酰水解酶(CPC-AH)可将已有的CPC水解为DCPC。其酶活性从120 h开始下降,至144 h仍然能观察到活性[6]

    近年来,原为细菌和古细菌的获得性自我免疫预防机制CRISPR/Cas9系统[7]在基因编辑领域大放异彩,在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,已实现多基因[8, 9]、多位点[10]、长片段(大于30 Kb)[11]的成功编辑,在米曲霉(Aspergillus oryzae[12]、构巢曲霉(Aspergillus nidulans[13]、里氏木霉(Trichoderma reesei[14]等真菌中有多种应用,极大提高了真菌中基因编辑的效率。顶头孢霉属于半知菌门真菌,与其他丝状真菌相比,其生长周期长且无有性生殖阶段,本实验室率先在其野生型CGMCC3.3795中构建了CRISPR/Cas9系统,并对聚酮合酶相关基因(sorAsorB)分别进行了敲除,编辑效率远高于传统方法[15]

    本研究利用CRISPR/Cas9系统,对顶头孢霉发酵过程中杂质DCPC累积问题进行了定向改造,通过构建cahB缺陷菌株与cefG过表达菌株,以期降低DPCP杂质含量,提高CPC产量与质量。

    • 顶头孢霉(A. chrysogenum)1-D1工业菌株、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α均由本实验室保藏。真菌表达质粒pAN7-1由本实验室保存,含RGR结构质粒pUC57由华大基因合成,含CRISPR-Cas9基因编辑系统质粒pAN7-sorA由本实验室构建与保存。

    • 麦芽汁培养基(用于工业顶头孢霉菌株斜面培养)、种子培养基(用于顶头孢霉菌株种子培养)、摇瓶发酵培养基(用于顶头孢霉菌株发酵)配方与培养方法参见文献[16],略有调整(种子培养基pH,7.2)。原生质体培养基与转化方法参见文献[14]

    • 高效液相色谱仪(日本岛津有限公司LC-20T):头孢菌素C(CPC)检测参见文献[16];DCPC含量检测:流动相:50%甲醇:磷酸盐溶液(3:97),流速:1 mL/min等度洗脱;检测波长:254 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μL;检测时间35 min。

    • 质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒:Axygen公司;真菌基因组抽提试剂盒、真菌RNA提取试剂盒:生工生物工程(上海)股份有限公司;Evo M-MLV Reverse Transcriptase反转录试剂盒与SYBR® Green Premix qPCR试剂盒:湖南艾科瑞生物工程有限公司;限制性内切酶:NEB公司;一步克隆试剂盒、Phanta酶等PCR酶:Vazyme公司;头孢菌素C(CPC)标准品与脱乙酰头孢菌素C标准品(含量未知)由国药集团山西威奇达药业有限公司馈赠。四丁基氢氧化铵(Tetrabutylammonium Hydroxide):色谱级,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。流动相磷酸盐(用于CPC与DCPC检测):磷酸盐溶液:850 mL超纯水中加入0.8 g NaH2PO4搅拌混匀后,用四丁基氢氧化铵调节pH至7.3,0.45 μm滤膜抽滤除杂,超声30 min去除气泡)。

    • 测序、引物合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。表1为引物列表。

      Primer nameSequence(5’-3’)
      sgcahB-1aactcaccgcgacgtAAGCTTtgccgc
      CTGATGAGTCCGTGAGGAC
      sgcahB-2catgtggccggtcttgccgc
      GACGAGCTTACTCGTTTC
      sgcahB-3gcggcaagaccggccacatg
      GTTTTAGAGCTAGAAATAGC
      sgcahB-4cagtaacgttaagtg
      ACTAGTTCGAGATGACCCAATGTCC
      R-pAN7-1-FttaatgtgaTAAagtagatgccgaccgcgg
      R-pAN7-1-Rgaggcgacatggtgatgtctgctcaagcgg
      pAN-cefG-Fagacatcaccatgtcgcctcagatcgccaatcgct
      pAN-cefG-Rgcatctacttcacattaatgactgatcgaggaatcc
      cahB-B1-F1gatgccatcacgagatttacgaaga
      cahB-B1-R1acaagggaattcccgtatagtctccgtctccataatc
      cahB-B2-F1ctccactcgaggactctccttattcctgcttacac
      cahB-B2-R1gccacttgattcagtaaccttctatg
      cahB-PT-F1agactatacgggaattcccttgtatctctacacacagg
      cahB-PT-R1tgttagtcaagctgcgatgaagt
      cahB-PT-F2gttgacaaggtcgttgcgtc
      cahB-PT-R2gaataaggagagtcctcgagtggagatgtggagtg
      C-veri-Fcgtcgagtacattgagcaggacgccattgt
      C-veri-Raaaggtttgtggaacacacgccagtgtccc
      C1-1gcagcacctacacctatgatgattctgc
      C1-2ttactggccgttgttgatgagaaggt
      C2-1attggaatgaacatgaatctgaggactgca
      C2-2gcttacctaccgaacatcatctcgaatcgt
      C3-1gggtacatactcatagcaacctacattg
      C3-2tacagagtcgaagaatatcctcttgacacc
      C4-1attaatgcattgactgcaacctagtaacgc
      C4-2gaggttaatctcgataacacacccaacaat
      cefG-F1cacgacgattcgagatgatgtt
      cefG-R1ccgactacggcagcaattt
      *大写字母为模板质粒pUC57中RGR特异性结构的骨架

      表 1  引物列表

      Table 1.  List of primers

    • 经NCBI数据库查询,得到顶头孢霉野生型(ATCC11550)头孢菌素C乙酰水解酶(CPC-AH)基因cahB(ACRE_083500),通过与工业菌1-D1全基因测序结果进行比对,找到工业菌中相对应的基因序列(GME1727_g)。通过sgRNA设计网站(https://gt-scan.csiro.au/submit/)进行靶目标序列设计,如下5’-gcggcaagaccggccacatgAGG-3’。设计引物(sgcahB-1, sgcahB-2)、(sgcahB-3, sgcahB-4),见表1。以pUC57为模板,进行PCR扩增,回收得到长度为84 bp与204 bp两片段,将片段进行融合PCR后获得可识别cahB基因的特异性sgRNA片段cahB-sgRNA。

      将质粒pAN7-sorA双酶切(HindIII、SpeI)胶回收含Cas9蛋白表达盒的大片段质粒骨架,与cahB-sgRNA片段一步克隆连接,构建pAN7-cahB质粒。将质粒转大肠DH5α感受态,挑取单菌落,液体培养后提质粒送测序。pAN7-cahB载体构建电泳图见图1

      图  1  载体pAN7-cahB构建电泳图。

      Figure 1.  The electrophoretogram of pAN7-cahB construction process. Fig A: cahB-sgRNA fragment (1:84 bp;2:204 bp;3:288 bp); Fig B: pAN7-sorA digested by HindIII and SpeI

    • 依据NCBI数据库中cefG序列(GI: 672794352),比对本实验室已有测序结果,获得工业菌株1-D1中cefG序列,设计引物,以1-D1基因组为模板扩增,获得cefG基因片段。以pAN7-1为模板,设计反向引物(R-pAN7-1-F,R-pAN7-1-R),PCR得到含启动子与终止子的反向骨架PgpdA-pAN7-Ttrpc,采用一步克隆的方法将骨架与cefG基因片段连接,构建cefG表达质粒pAN7-1-cefG,进行大肠杆菌感受态转化,挑单菌落菌落PCR初步验证后,提质粒送测序。

      图  2  pAN7-1-cefG构建电泳图。

      Figure 2.  Electrophoresis map of the pAN7-1-cefG construction.

      Donor DNA构建流程与原理见图3。首先,依据1-D1测序结果,选取cahB基因上下游长度为1 000 bp左右片段作为同源臂扩增获得同源臂B1、B2。以Split-Marker重组技术为原理,设计引物(cahB-PT-F1,cahB-PT-R1)、(cahB-PT-F2,cahB-PT-R2),将同源修复片段分上下游片段进行导入。将质粒上PgpdA-cefG-Ttrpc表达盒分两部分进行扩增得到PgpdA-cefG(2 286 bp)、cefG-TtrpC(2 370 bp),中间含200 bp重叠区。电泳条带见图4(a)。采取融合PCR方式与上下游分别连接,获得Donor DNA(B1-PgpdA-cefG、cefG-TtrpC-B2),见图4(b)

      图  3  Donor DNA构建流程图

      Figure 3.  Donor DNA generation flow chart

      图  4  Donor DNA构建电泳图。

      Figure 4.  Donor DNA construction electrophoretograms.

    • 将构建完成的pAN7-cahB质粒与同源修复片段(B1-CEFG、CEFG -B2)进行顶头孢霉原生质体共同转化,在PEG介导下,将外源质粒与同源修复表达盒导入菌体内,进行特异性打靶与同源修复。转化时,外源质粒的量为8~10 μg,质粒与片段质量比为4:1:1,总体积不超过20 μL(当无需同源修复片段协同作用时,外源质粒所需量不变但总体积不超过10 μL)。当外源核酸物质与原生质体轻柔混匀后,将该体系与上层培养基混合后倒至含有下层转化培养基的平板中,28 ℃培养10~12 d,待转化板长出半透明的白色菌落,使用已灭菌牙签转移至麦芽汁平板(潮霉素抗性:150 μg/mL),28 ℃培养7 d。转化步骤见图5

      图  5  原生质体转化实验流程图

      Figure 5.  The flow chart of protoplast transformation experiment

    • 在PAM序列上下游500~1 000 bp处设计引物,以基因组为模板进行PCR,获得的片段(1 500 bp),通过T7EI酶切来初步验证是否与基因组有错配碱基(图6(b)),再送生工进行测序验证。将测序结果与基因组进行比对,发现在PAM序列上游有碱基缺失,5’-gcggcaagaccggccac--gAGG-3’。将转化子进行遗传稳定性验证,发现传代至第5代基因组中碱基缺失仍然存在,说明单质粒转化其敲除后遗传稳定性良好,没有产生回复突变。

      图  6  Ac-ΔcahB转化子验证结果。

      Figure 6.  Ac-ΔcahB transformant validation results.

      单质粒转化在验证时发现,部分转化子无法PCR获得验证片段,这可能是由于Cas9蛋白造成的双链断裂所引发的NHEJ,导致基因组其他部分的大片段插入与缺失,使验证引物无法与基因组匹配。但是由于其插入与缺失长度的不确定性,无法很好通过调整引物与片段长度解决,故采取单质粒与Donor DNA共转方式能较好解决突变株验证问题。

    • 转化子验证原理图见图7,首先,以(C1-1,C1-2)为引物扩增靶基因序列,对照组1-D1有扩增片段,实验组应无扩增片段;而以(C2-1,C2-2)为引物扩增同源修复片段中cefG基因表达盒的部分序列,对照组1-D1应无扩增片段,实验组应有扩增片段;再以(C3-1,C3-2)、(C4-1,C4-2)为引物分别扩增上游同源臂B1与表达盒启动子部分、表达盒终止子与下游同源臂B2,对照组1-D1应无扩增片段,实验组应有扩增片段。最后用(C3-1,C4-2)为引物扩增时,对照组与实验组条带长度有明显差异,电泳结果见图8

      图  7  Ac-ΔcahB::cefG验证原理图

      Figure 7.  Ac-ΔcahB::cefG verification principle diagram

      图  8  Ac-ΔcahB::cefG PCR验证图。

      Figure 8.  Ac-ΔcahB::cefG PCR verification chart.

    • 取培养72、96 h后的顶头孢霉改造菌株Ac-ΔcahB、Ac-ΔcahB::cefG与出发菌株1-D1的发酵液,去尽上清用DEPC水洗涤3次后,进行液氮研磨,按照真菌RNA提取试剂盒说明书要求进行RNA提取。确认RNA质量与浓度后,使用Evo M-MLV Reverse Transcriptase反转录试剂盒说明书进行反转录制备cDNA。以此为模版,(cefG-F1,cefG-R1)为引物,使用SYBR® Green Premix qPCR试剂盒进行RT-PCR扩增。

    • 将突变株Ac-ΔcahB、Ac-ΔcahB::cefG与对照工业菌株1-D1进行了168 h的液体摇瓶发酵,对CPC产量与杂质DCPC含量进行了比较研究。头孢菌素C产量如图9所示,突变株Ac-ΔcahB的产量4 665 μg/mL,出发菌株产量为4 578 μg/mL,两者发酵水平相接近。而突变株Ac-ΔcahB::cefG产量为6 072 μg/mL,相较于出发菌株,总体提高了32.6%,差异显著(P=0.025 9)。通过插入强化表达的cefG基因,使DCPC得到有效转化,减少了菌体中的积累,在降低杂质的同时进一步提高了CPC的产量。

      图  9  出发菌株与突变株CPC产量比较。数据代表三个重复试验的平均值和标准偏差。使用单因素方差分析对顶头孢霉1-D1与两个突变株的CPC产量差异进行统计学意义比较(***p <0.001; **p < 0.01; *p < 0.05)。

      Figure 9.  CPC production comparison of starting strain and mutant strain. Data represent the average values and standard deviations from three replicates. Statistical significance was performed using a one-way analysis of variance to compare the CPC concentration differences between A. chrysogenum 1-D1 and each of the two mutants (***p <0.001; **p < 0.01; *p < 0.05).

      cahB基因是CPC乙酰水解酶基因,可将CPC水解成为无经济价值的DCPC。但是在此结果中发现,敲除该基因后头孢菌素C并未达到预期中有明显提高的效果,这可能因为水解的CPC在总产量中所占比重比较小。有学者对头孢菌素C乙酰水解酶进行了酶动力学反应研究,结果表明,纯化至均质的酶蛋白显示与CPC的亲和力不高(Km 33.7 mmol/L),同时发现其酶活性在发酵至120 h时开始逐渐下降[6]。底物CPC浓度较低时,该酶结合转化的效率较低,水解能力较弱,因该酶水解的CPC在总产量中所占比重比较小,故敲除后CPC产量没有明显提升。此外,在对基因组进行分析时发现,菌体中有可能存在其他CPC水解酶,如GME4736_g与GME1825_g(图10),其分别注释为碱性蛋白酶(Alkaline proteinase)与角质层降解蛋白酶(Cuticle-degrading protease),均具有丝氨酸型肽链内切酶活性,而cahB与枯草芽孢杆菌的丝氨酸蛋白质家族具有高同源性。相较于cahB,可能这些注释为丝氨酸家族的蛋白质基因对CPC的水解起着主导作用。

      图  10  CPC合成与分解相关基因

      Figure 10.  Genes involved in CPC synthesis and decomposition

    • 目前,行业中常以DCPC与CPC的峰面积的比值来对DCPC含量进行相对定量,如图11所示。菌株Ac-ΔcahB::cefG色谱图中可发现DCPC峰面积占比低于其他两菌株。DCPC含量占比结果如图12所显示,突变株中DCPC的含量有不同程度的下降,单敲除菌种中下降约1.32%,与此前CPC含量并未有大幅度变化相一致。而菌株Ac-ΔcahB::cefG在DCPC相对含量上与出发菌株差异非常显著,下降约5.84%,与cefG的过表达可提高DCPC转化效率的设想相一致,在CPC的生产方面有较大提升。

      图  11  出发菌株与突变株发酵液高效液相色谱图。

      Figure 11.  DCPC content comparison of starting strain and mutant strain. Fig. A: original strain (1-D1); Fig. B: Mutant strain Ac-ΔcahB; Fig. B: Mutant strain ΔcahB::cefG

      图  12  出发菌株与突变株DCPC含量比较。

      Figure 12.  DCPC content comparison of starting strain and mutant strain.

    • 以出发菌株1-D1为对照,提取发酵72 h与96 h的菌体RNA进行荧光定量PCR(RT-qPCR)分析。分别以菌株中γ-actin为内参基因进行矫正,对DCPC乙酰转移酶基因cefG进行表达量测定(图13)。在顶头孢霉中,DCPC乙酰转移酶基因cefG内源性启动子较弱,基因表达强度较低一直是CPC生产过程中的限制性步骤。在Ac-ΔcahB::cefG菌株中,强启动子PgpdA提高了cefG表达量,且上调倍数高达5倍。DCPC乙酰转移酶基因转录量的提升可能增加了菌体内乙酰转移酶的含量,从而提高了菌体对中间产物DCPC的转化效率,促进了CPC合成。

      图  13  DCPC乙酰转移酶基因cefG表达量测定

      Figure 13.  Determination of cefG expression of DCPC acetyltransferase gene

    • 头孢菌素类抗生素因其低毒、抗菌谱广、作用效果好等特点被广泛应用于临床治疗中,而头孢菌素C作为头孢菌素类抗生素的重要原料,其生产菌株顶头孢霉的发酵却常有中间产物与类似物作为杂质残留,对CPC产量以及分离纯化造成影响。

      本研究运用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建了Ac-ΔcahB菌株,并通过结合Donor DNA,优化了敲除效率,构建了Ac-ΔcahB::cefG菌株。cahB基因的敲除虽不能有效提高CPC产量,但是从适宜种龄以及平板培养等其他生长状况而言,该基因的敲除对菌体生长并没有过多影响。或许,相较于以往随机插入的过表达方法,将cahB基因作为定点整合位点,是一个便于验证的不错选择。此外,在对基因组进行分析时发现,菌体中有可能存在其他CPC水解酶,如GME4736_g与GME1825_g,分别注释为碱性蛋白酶(Alkaline proteinase)与角质层降解蛋白酶(Cuticle-degrading protease),均具有丝氨酸型肽链内切酶活性,而cahB与枯草芽孢杆菌的丝氨酸蛋白质家族基因具有高同源性。相较于cahB,可能这些注释为丝氨酸家族的蛋白质基因对CPC的水解起着主导作用。而插入强启动子PgpdA过表达的cefG基因,使突变菌株Ac-ΔcahB::cefG该基因在转录水平表达量提高了5倍。并且在CPC生产与DCPC杂质方面较出发菌株均差异显著,既将CPC产量提高32.6%又将DCPC含量控制在6.81%。此外,发酵培养基的有效利用,提高了经济效益,同时由于DCPC含量的降低,减少了废液中抗生素的残留,从而减小了废液排放对环境的影响。

(13)  表(1) 参考文献 (16)

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