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19世纪50年代，头孢菌素C（CPC）被Abraham和Newton两位学者从顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）培养液中分离鉴定[1-2]，随后，以CPC为原料的头孢菌素类抗生素逐渐成为世界抗生素市场的重要一员。该类抗生素属于β-内酰胺类抗生素，具有广谱抗菌性，且相较于青霉素，其疗效更好，安全性高，副作用少。此外，由于CPC中二氢噻嗪环与β-内酰胺环相连的特殊母核结构，使其具有更好的青霉素酶耐受性[3]。
头孢菌素C去除支链后得到的7-氨基头孢烷酸（7-ACA）是各类头孢菌素衍生药物的起点化合物，常通过发酵手段获得。其中脱乙酰头孢菌素C（DCPC）是发酵生产中一种主要副产物，结构与性质和CPC极为相似，两者均为氨基酸，且常以内铵盐形式存在，发酵生产中含量约为CPC的15%~20%[4]。在现有的生产工艺中，DCPC虽能够与主产物CPC进行分离，但其在余液中的大量残留会造成环境污染。抗生素的长期累积，会使周围土壤微生物与动植物生长进化均会受到影响，长此以往，相关联的上下游生物也会受到干扰，从而影响该地区的生态平衡。虽然目前有许多学者对CPC废液中副产物的再利用进行了大量的研究，但是由于可操作性与经济效益等问题，真正应用于实际生产的还少之又少。
DCPC的产生积累有两方面原因：一方面，顶头孢霉自身DCPC乙酰转移酶（DCPC-AT）启动子强度不足，转录量低，使DCPC无法有效转化为CPC，成为生产过程中的限制性步骤之一[5]；另一方面，顶头孢霉Ⅷ染色体上含有CPC乙酰水解酶基因（cahB），菌体经72 h培养后可编码表达一个1.4 Kb的单链转录子，翻译出的乙酰水解酶（CPC-AH）可将已有的CPC水解为DCPC。其酶活性从120 h开始下降，至144 h仍然能观察到活性[6]。
近年来，原为细菌和古细菌的获得性自我免疫预防机制CRISPR/Cas9系统[7]在基因编辑领域大放异彩，在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，已实现多基因[8, 9]、多位点[10]、长片段（大于30 Kb）[11]的成功编辑，在米曲霉（Aspergillus oryzae）[12]、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）[13]、里氏木霉（Trichoderma reesei）[14]等真菌中有多种应用，极大提高了真菌中基因编辑的效率。顶头孢霉属于半知菌门真菌，与其他丝状真菌相比，其生长周期长且无有性生殖阶段，本实验室率先在其野生型CGMCC3.3795中构建了CRISPR/Cas9系统，并对聚酮合酶相关基因（sorA、sorB）分别进行了敲除，编辑效率远高于传统方法[15]。
本研究利用CRISPR/Cas9系统，对顶头孢霉发酵过程中杂质DCPC累积问题进行了定向改造，通过构建cahB缺陷菌株与cefG过表达菌株，以期降低DPCP杂质含量，提高CPC产量与质量。
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顶头孢霉（A. chrysogenum）1-D1工业菌株、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α均由本实验室保藏。真菌表达质粒pAN7-1由本实验室保存，含RGR结构质粒pUC57由华大基因合成，含CRISPR-Cas9基因编辑系统质粒pAN7-sorA由本实验室构建与保存。
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麦芽汁培养基（用于工业顶头孢霉菌株斜面培养）、种子培养基（用于顶头孢霉菌株种子培养）、摇瓶发酵培养基（用于顶头孢霉菌株发酵）配方与培养方法参见文献[16]，略有调整（种子培养基pH，7.2）。原生质体培养基与转化方法参见文献[14]。
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高效液相色谱仪（日本岛津有限公司LC-20T）：头孢菌素C（CPC）检测参见文献[16]；DCPC含量检测：流动相：50%甲醇：磷酸盐溶液（3:97），流速：1 mL/min等度洗脱；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；检测时间35 min。
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质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒：Axygen公司；真菌基因组抽提试剂盒、真菌RNA提取试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；Evo M-MLV Reverse Transcriptase反转录试剂盒与SYBR® Green Premix qPCR试剂盒：湖南艾科瑞生物工程有限公司；限制性内切酶：NEB公司；一步克隆试剂盒、Phanta酶等PCR酶：Vazyme公司；头孢菌素C（CPC）标准品与脱乙酰头孢菌素C标准品（含量未知）由国药集团山西威奇达药业有限公司馈赠。四丁基氢氧化铵（Tetrabutylammonium Hydroxide）：色谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。流动相磷酸盐（用于CPC与DCPC检测）：磷酸盐溶液：850 mL超纯水中加入0.8 g NaH2PO4搅拌混匀后，用四丁基氢氧化铵调节pH至7.3，0.45 μm滤膜抽滤除杂，超声30 min去除气泡）。
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测序、引物合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。表1为引物列表。
Primer name Sequence（5’-3’） sgcahB-1 aactcaccgcgacgtAAGCTTtgccgc
CTGATGAGTCCGTGAGGACsgcahB-2 catgtggccggtcttgccgc
GACGAGCTTACTCGTTTCsgcahB-3 gcggcaagaccggccacatg
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCsgcahB-4 cagtaacgttaagtg
ACTAGTTCGAGATGACCCAATGTCCR-pAN7-1-F ttaatgtgaTAAagtagatgccgaccgcgg R-pAN7-1-R gaggcgacatggtgatgtctgctcaagcgg pAN-cefG-F agacatcaccatgtcgcctcagatcgccaatcgct pAN-cefG-R gcatctacttcacattaatgactgatcgaggaatcc cahB-B1-F1 gatgccatcacgagatttacgaaga cahB-B1-R1 acaagggaattcccgtatagtctccgtctccataatc cahB-B2-F1 ctccactcgaggactctccttattcctgcttacac cahB-B2-R1 gccacttgattcagtaaccttctatg cahB-PT-F1 agactatacgggaattcccttgtatctctacacacagg cahB-PT-R1 tgttagtcaagctgcgatgaagt cahB-PT-F2 gttgacaaggtcgttgcgtc cahB-PT-R2 gaataaggagagtcctcgagtggagatgtggagtg C-veri-F cgtcgagtacattgagcaggacgccattgt C-veri-R aaaggtttgtggaacacacgccagtgtccc C1-1 gcagcacctacacctatgatgattctgc C1-2 ttactggccgttgttgatgagaaggt C2-1 attggaatgaacatgaatctgaggactgca C2-2 gcttacctaccgaacatcatctcgaatcgt C3-1 gggtacatactcatagcaacctacattg C3-2 tacagagtcgaagaatatcctcttgacacc C4-1 attaatgcattgactgcaacctagtaacgc C4-2 gaggttaatctcgataacacacccaacaat cefG-F1 cacgacgattcgagatgatgtt cefG-R1 ccgactacggcagcaattt *大写字母为模板质粒pUC57中RGR特异性结构的骨架 表 1 引物列表
Table 1. List of primers
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经NCBI数据库查询，得到顶头孢霉野生型（ATCC11550）头孢菌素C乙酰水解酶（CPC-AH）基因cahB（ACRE_083500），通过与工业菌1-D1全基因测序结果进行比对，找到工业菌中相对应的基因序列（GME1727_g）。通过sgRNA设计网站（https://gt-scan.csiro.au/submit/）进行靶目标序列设计，如下5’-gcggcaagaccggccacatgAGG-3’。设计引物（sgcahB-1, sgcahB-2）、（sgcahB-3, sgcahB-4），见表1。以pUC57为模板，进行PCR扩增，回收得到长度为84 bp与204 bp两片段，将片段进行融合PCR后获得可识别cahB基因的特异性sgRNA片段cahB-sgRNA。
将质粒pAN7-sorA双酶切（HindIII、SpeI）胶回收含Cas9蛋白表达盒的大片段质粒骨架，与cahB-sgRNA片段一步克隆连接，构建pAN7-cahB质粒。将质粒转大肠DH5α感受态，挑取单菌落，液体培养后提质粒送测序。pAN7-cahB载体构建电泳图见图1。
图 1 载体pAN7-cahB构建电泳图。
Figure 1. The electrophoretogram of pAN7-cahB construction process. Fig A: cahB-sgRNA fragment (1:84 bp;2:204 bp;3:288 bp); Fig B: pAN7-sorA digested by HindIII and SpeI
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依据NCBI数据库中cefG序列（GI: 672794352），比对本实验室已有测序结果，获得工业菌株1-D1中cefG序列，设计引物，以1-D1基因组为模板扩增，获得cefG基因片段。以pAN7-1为模板，设计反向引物（R-pAN7-1-F，R-pAN7-1-R），PCR得到含启动子与终止子的反向骨架PgpdA-pAN7-Ttrpc，采用一步克隆的方法将骨架与cefG基因片段连接，构建cefG表达质粒pAN7-1-cefG，进行大肠杆菌感受态转化，挑单菌落菌落PCR初步验证后，提质粒送测序。
图 2 pAN7-1-cefG构建电泳图。
Figure 2. Electrophoresis map of the pAN7-1-cefG construction.
Donor DNA构建流程与原理见图3。首先，依据1-D1测序结果，选取cahB基因上下游长度为1 000 bp左右片段作为同源臂扩增获得同源臂B1、B2。以Split-Marker重组技术为原理，设计引物（cahB-PT-F1，cahB-PT-R1）、（cahB-PT-F2，cahB-PT-R2），将同源修复片段分上下游片段进行导入。将质粒上PgpdA-cefG-Ttrpc表达盒分两部分进行扩增得到PgpdA-cefG（2 286 bp）、cefG-TtrpC（2 370 bp），中间含200 bp重叠区。电泳条带见图4（a）。采取融合PCR方式与上下游分别连接，获得Donor DNA（B1-PgpdA-cefG、cefG-TtrpC-B2），见图4（b）。
图 3 Donor DNA构建流程图
Figure 3. Donor DNA generation flow chart
图 4 Donor DNA构建电泳图。
Figure 4. Donor DNA construction electrophoretograms.
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将构建完成的pAN7-cahB质粒与同源修复片段（B1-CEFG、CEFG -B2）进行顶头孢霉原生质体共同转化，在PEG介导下，将外源质粒与同源修复表达盒导入菌体内，进行特异性打靶与同源修复。转化时，外源质粒的量为8~10 μg，质粒与片段质量比为4:1:1，总体积不超过20 μL（当无需同源修复片段协同作用时，外源质粒所需量不变但总体积不超过10 μL）。当外源核酸物质与原生质体轻柔混匀后，将该体系与上层培养基混合后倒至含有下层转化培养基的平板中，28 ℃培养10~12 d，待转化板长出半透明的白色菌落，使用已灭菌牙签转移至麦芽汁平板（潮霉素抗性：150 μg/mL），28 ℃培养7 d。转化步骤见图5。
图 5 原生质体转化实验流程图
Figure 5. The flow chart of protoplast transformation experiment
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在PAM序列上下游500~1 000 bp处设计引物，以基因组为模板进行PCR，获得的片段（1 500 bp），通过T7EI酶切来初步验证是否与基因组有错配碱基（图6（b）），再送生工进行测序验证。将测序结果与基因组进行比对，发现在PAM序列上游有碱基缺失，5’-gcggcaagaccggccac--gAGG-3’。将转化子进行遗传稳定性验证，发现传代至第5代基因组中碱基缺失仍然存在，说明单质粒转化其敲除后遗传稳定性良好，没有产生回复突变。
图 6 Ac-ΔcahB转化子验证结果。
Figure 6. Ac-ΔcahB transformant validation results.
单质粒转化在验证时发现，部分转化子无法PCR获得验证片段，这可能是由于Cas9蛋白造成的双链断裂所引发的NHEJ，导致基因组其他部分的大片段插入与缺失，使验证引物无法与基因组匹配。但是由于其插入与缺失长度的不确定性，无法很好通过调整引物与片段长度解决，故采取单质粒与Donor DNA共转方式能较好解决突变株验证问题。
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转化子验证原理图见图7，首先，以（C1-1，C1-2）为引物扩增靶基因序列，对照组1-D1有扩增片段，实验组应无扩增片段；而以（C2-1，C2-2）为引物扩增同源修复片段中cefG基因表达盒的部分序列，对照组1-D1应无扩增片段，实验组应有扩增片段；再以（C3-1，C3-2）、（C4-1，C4-2）为引物分别扩增上游同源臂B1与表达盒启动子部分、表达盒终止子与下游同源臂B2，对照组1-D1应无扩增片段，实验组应有扩增片段。最后用（C3-1，C4-2）为引物扩增时，对照组与实验组条带长度有明显差异，电泳结果见图8。
图 7 Ac-ΔcahB::cefG验证原理图
Figure 7. Ac-ΔcahB::cefG verification principle diagram
图 8 Ac-ΔcahB::cefG PCR验证图。
Figure 8. Ac-ΔcahB::cefG PCR verification chart.
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取培养72、96 h后的顶头孢霉改造菌株Ac-ΔcahB、Ac-ΔcahB::cefG与出发菌株1-D1的发酵液，去尽上清用DEPC水洗涤3次后，进行液氮研磨，按照真菌RNA提取试剂盒说明书要求进行RNA提取。确认RNA质量与浓度后，使用Evo M-MLV Reverse Transcriptase反转录试剂盒说明书进行反转录制备cDNA。以此为模版，（cefG-F1，cefG-R1）为引物，使用SYBR® Green Premix qPCR试剂盒进行RT-PCR扩增。
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将突变株Ac-ΔcahB、Ac-ΔcahB::cefG与对照工业菌株1-D1进行了168 h的液体摇瓶发酵，对CPC产量与杂质DCPC含量进行了比较研究。头孢菌素C产量如图9所示，突变株Ac-ΔcahB的产量4 665 μg/mL，出发菌株产量为4 578 μg/mL，两者发酵水平相接近。而突变株Ac-ΔcahB::cefG产量为6 072 μg/mL，相较于出发菌株，总体提高了32.6%，差异显著（P=0.025 9）。通过插入强化表达的cefG基因，使DCPC得到有效转化，减少了菌体中的积累，在降低杂质的同时进一步提高了CPC的产量。
图 9 出发菌株与突变株CPC产量比较。数据代表三个重复试验的平均值和标准偏差。使用单因素方差分析对顶头孢霉1-D1与两个突变株的CPC产量差异进行统计学意义比较（***p <0.001; **p < 0.01; *p < 0.05）。
Figure 9. CPC production comparison of starting strain and mutant strain. Data represent the average values and standard deviations from three replicates. Statistical significance was performed using a one-way analysis of variance to compare the CPC concentration differences between A. chrysogenum 1-D1 and each of the two mutants (***p <0.001; **p < 0.01; *p < 0.05).
cahB基因是CPC乙酰水解酶基因，可将CPC水解成为无经济价值的DCPC。但是在此结果中发现，敲除该基因后头孢菌素C并未达到预期中有明显提高的效果，这可能因为水解的CPC在总产量中所占比重比较小。有学者对头孢菌素C乙酰水解酶进行了酶动力学反应研究，结果表明，纯化至均质的酶蛋白显示与CPC的亲和力不高（Km 33.7 mmol/L），同时发现其酶活性在发酵至120 h时开始逐渐下降[6]。底物CPC浓度较低时，该酶结合转化的效率较低，水解能力较弱，因该酶水解的CPC在总产量中所占比重比较小，故敲除后CPC产量没有明显提升。此外，在对基因组进行分析时发现，菌体中有可能存在其他CPC水解酶，如GME4736_g与GME1825_g（图10），其分别注释为碱性蛋白酶（Alkaline proteinase）与角质层降解蛋白酶（Cuticle-degrading protease），均具有丝氨酸型肽链内切酶活性，而cahB与枯草芽孢杆菌的丝氨酸蛋白质家族具有高同源性。相较于cahB，可能这些注释为丝氨酸家族的蛋白质基因对CPC的水解起着主导作用。
图 10 CPC合成与分解相关基因
Figure 10. Genes involved in CPC synthesis and decomposition
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目前，行业中常以DCPC与CPC的峰面积的比值来对DCPC含量进行相对定量，如图11所示。菌株Ac-ΔcahB::cefG色谱图中可发现DCPC峰面积占比低于其他两菌株。DCPC含量占比结果如图12所显示，突变株中DCPC的含量有不同程度的下降，单敲除菌种中下降约1.32%，与此前CPC含量并未有大幅度变化相一致。而菌株Ac-ΔcahB::cefG在DCPC相对含量上与出发菌株差异非常显著，下降约5.84%，与cefG的过表达可提高DCPC转化效率的设想相一致，在CPC的生产方面有较大提升。
图 11 出发菌株与突变株发酵液高效液相色谱图。
Figure 11. DCPC content comparison of starting strain and mutant strain. Fig. A: original strain (1-D1); Fig. B: Mutant strain Ac-ΔcahB; Fig. B: Mutant strain ΔcahB::cefG
图 12 出发菌株与突变株DCPC含量比较。
Figure 12. DCPC content comparison of starting strain and mutant strain.
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以出发菌株1-D1为对照，提取发酵72 h与96 h的菌体RNA进行荧光定量PCR（RT-qPCR）分析。分别以菌株中γ-actin为内参基因进行矫正，对DCPC乙酰转移酶基因cefG进行表达量测定（图13）。在顶头孢霉中，DCPC乙酰转移酶基因cefG内源性启动子较弱，基因表达强度较低一直是CPC生产过程中的限制性步骤。在Ac-ΔcahB::cefG菌株中，强启动子PgpdA提高了cefG表达量，且上调倍数高达5倍。DCPC乙酰转移酶基因转录量的提升可能增加了菌体内乙酰转移酶的含量，从而提高了菌体对中间产物DCPC的转化效率，促进了CPC合成。
图 13 DCPC乙酰转移酶基因cefG表达量测定
Figure 13. Determination of cefG expression of DCPC acetyltransferase gene
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头孢菌素类抗生素因其低毒、抗菌谱广、作用效果好等特点被广泛应用于临床治疗中，而头孢菌素C作为头孢菌素类抗生素的重要原料，其生产菌株顶头孢霉的发酵却常有中间产物与类似物作为杂质残留，对CPC产量以及分离纯化造成影响。
本研究运用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建了Ac-ΔcahB菌株，并通过结合Donor DNA，优化了敲除效率，构建了Ac-ΔcahB::cefG菌株。cahB基因的敲除虽不能有效提高CPC产量，但是从适宜种龄以及平板培养等其他生长状况而言，该基因的敲除对菌体生长并没有过多影响。或许，相较于以往随机插入的过表达方法，将cahB基因作为定点整合位点，是一个便于验证的不错选择。此外，在对基因组进行分析时发现，菌体中有可能存在其他CPC水解酶，如GME4736_g与GME1825_g，分别注释为碱性蛋白酶（Alkaline proteinase）与角质层降解蛋白酶（Cuticle-degrading protease），均具有丝氨酸型肽链内切酶活性，而cahB与枯草芽孢杆菌的丝氨酸蛋白质家族基因具有高同源性。相较于cahB，可能这些注释为丝氨酸家族的蛋白质基因对CPC的水解起着主导作用。而插入强启动子PgpdA过表达的cefG基因，使突变菌株Ac-ΔcahB::cefG该基因在转录水平表达量提高了5倍。并且在CPC生产与DCPC杂质方面较出发菌株均差异显著，既将CPC产量提高32.6%又将DCPC含量控制在6.81%。此外，发酵培养基的有效利用，提高了经济效益，同时由于DCPC含量的降低，减少了废液中抗生素的残留，从而减小了废液排放对环境的影响。
利用CRISPR/Cas9系统构建低DCPC杂质含量的CPC工业高产菌种
Construction of CPC high-yield industrial strain with low DCPC content using CRISPR / Cas9 system
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摘要: 以头孢菌素C（CPC）工业生产菌株顶头孢霉1-D1为研究对象，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术降低杂质脱乙酰头孢菌素C（DCPC）累积，提高CPC产量与质量。首先，构建了CPC乙酰水解酶敲除菌株Ac-ΔcahB以期减少CPC水解。然后通过导入含cefG基因表达盒的Donor DNA，构建Ac-ΔcahB::cefG菌株以期提高DCPC转化效率。通过摇瓶发酵验证表明Ac-ΔcahB效价未有提高仅杂质含量略有下降，而Ac-ΔcahB::cefG不仅产量比对照提高约32.6%，达6 072 μg/mL，且杂质含量显著降低，为6.81%。从cefG转录水平来看，Ac-ΔcahB::cefG菌株在96 h转录量提高了5倍。可以发现，cefG基因在强启动子PgpdA作用下可提高表达量，促进DCPC转化，从而提高CPC产量。此外，在工业顶头孢霉中，结合Donor DNA共同作用的CRISPR/Cas9系统是一个更为高效的基因编辑方法。
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关键词:
- 顶头孢霉 /
- cefG /
- cahB /
- CRISPR/Cas9
Abstract: The CRISPR/Cas9 mediated gene editing was used in a cephalosporin C (CPC) industrial producer Acremonium chrysogenum 1-D1 to improve the production and quality of CPC by reducing the accumulation of by-product deacetylcephalosporin C (DCPC). Firstly, we used the CRISPR/Cas9 system to knock out the CPC acetylhydrolase gene cahB to reduce the accumulation of impurities DCPC, and a strain Ac-ΔcahB with 2 bp deletions in cahB was obtained. Secondly, we inserted donor DNA, which contained a cefG gene that encodes DCPC acetyltransferase into the cahB locus by using the HDR and CRISPR, thus the cahB deletion strain Ac-ΔcahB::cefG combined with cefG overexpression capability, was obtained. It was found that the CPC production of strain Ac-ΔcahB was only increased slightly, while strain Ac-ΔcahB::cefG produced 6072 μg/ml of CPC after 168 h cultivation, which was increased by 32.6% compared to the original strain (1-D1). Moreover, the ratio of the peak area of DCPC to CPC was employed to determine the DCPC content. The results showed that the DCPC content of strain Ac-ΔcahB was slightly decreased from 12.56% of original strain to 11.33%. However, the DCPC content in the strain Ac-ΔcahB::cefG was dramatically dropped to 6.81%, which decreased significantly (P=0.001797) comparing to the original strain. In addition, the expression levels of the acetyltransferase gene cefG in both functional strains were increased in 72 h and 96 h, and the transcription level of Ac-ΔcahB::cefG strain was increased by 5 times at 96 h. These results suggested that the overexpression of cefG gene by the strong promoter gpdA greatly increased the transcription of acetyltransferase gene, and promoted the conversion of DCPC to CPC. Thus, the accumulation of DCPC was significantly reduced and the production of CPC was improved. And the CRISPR/Cas9 system combined with Donor DNA is a more efficient gene editing method to be applied to industrial A. chrysogenum.-
Key words:
- Acremonium chrysogenum /
- cefG /
- cahB /
- CRISPR/Cas9
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图 1 载体pAN7-cahB构建电泳图。
Figure 1. The electrophoretogram of pAN7-cahB construction process. Fig A: cahB-sgRNA fragment (1:84 bp;2:204 bp;3:288 bp); Fig B: pAN7-sorA digested by HindIII and SpeI
图 9 出发菌株与突变株CPC产量比较。数据代表三个重复试验的平均值和标准偏差。使用单因素方差分析对顶头孢霉1-D1与两个突变株的CPC产量差异进行统计学意义比较（***p <0.001; **p < 0.01; *p < 0.05）。
Figure 9. CPC production comparison of starting strain and mutant strain. Data represent the average values and standard deviations from three replicates. Statistical significance was performed using a one-way analysis of variance to compare the CPC concentration differences between A. chrysogenum 1-D1 and each of the two mutants (***p <0.001; **p < 0.01; *p < 0.05).
图 11 出发菌株与突变株发酵液高效液相色谱图。
Figure 11. DCPC content comparison of starting strain and mutant strain. Fig. A: original strain (1-D1); Fig. B: Mutant strain Ac-ΔcahB; Fig. B: Mutant strain ΔcahB::cefG
图 12 出发菌株与突变株DCPC含量比较。
Figure 12. DCPC content comparison of starting strain and mutant strain.
图 13 DCPC乙酰转移酶基因cefG表达量测定
Figure 13. Determination of cefG expression of DCPC acetyltransferase gene
表 1 引物列表
Table 1. List of primers
Primer name Sequence（5’-3’） sgcahB-1 aactcaccgcgacgtAAGCTTtgccgc
CTGATGAGTCCGTGAGGACsgcahB-2 catgtggccggtcttgccgc
GACGAGCTTACTCGTTTCsgcahB-3 gcggcaagaccggccacatg
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCsgcahB-4 cagtaacgttaagtg
ACTAGTTCGAGATGACCCAATGTCCR-pAN7-1-F ttaatgtgaTAAagtagatgccgaccgcgg R-pAN7-1-R gaggcgacatggtgatgtctgctcaagcgg pAN-cefG-F agacatcaccatgtcgcctcagatcgccaatcgct pAN-cefG-R gcatctacttcacattaatgactgatcgaggaatcc cahB-B1-F1 gatgccatcacgagatttacgaaga cahB-B1-R1 acaagggaattcccgtatagtctccgtctccataatc cahB-B2-F1 ctccactcgaggactctccttattcctgcttacac cahB-B2-R1 gccacttgattcagtaaccttctatg cahB-PT-F1 agactatacgggaattcccttgtatctctacacacagg cahB-PT-R1 tgttagtcaagctgcgatgaagt cahB-PT-F2 gttgacaaggtcgttgcgtc cahB-PT-R2 gaataaggagagtcctcgagtggagatgtggagtg C-veri-F cgtcgagtacattgagcaggacgccattgt C-veri-R aaaggtttgtggaacacacgccagtgtccc C1-1 gcagcacctacacctatgatgattctgc C1-2 ttactggccgttgttgatgagaaggt C2-1 attggaatgaacatgaatctgaggactgca C2-2 gcttacctaccgaacatcatctcgaatcgt C3-1 gggtacatactcatagcaacctacattg C3-2 tacagagtcgaagaatatcctcttgacacc C4-1 attaatgcattgactgcaacctagtaacgc C4-2 gaggttaatctcgataacacacccaacaat cefG-F1 cacgacgattcgagatgatgtt cefG-R1 ccgactacggcagcaattt *大写字母为模板质粒pUC57中RGR特异性结构的骨架 
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