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  • ISSN 1006-3080
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靶向心肌组织的新型腺相关病毒载体的构建及筛选

    作者简介: 陈 晨(1994-),男,甘肃省兰州市人,硕士生,主要研究方向为基因治疗。E-mail:cchenecust@163.com;
    通讯作者: 郑静, zhengjing@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: Q819

Novel Cardiac-tropic Adeno-associated virus (AAV) Vectors Generated by DNA Shuffling and in vivo Screening

    Corresponding author: Jing ZHENG, zhengjing@ecust.edu.cn
  • CLC number: Q819

  • 摘要: 为了构建以心肌为靶点的基因治疗载体,通过DNA shuffling技术对选择的8种AAV(AAV1-4,AAV6-9)衣壳基因进行了重组,构建了随机突变体AAV衣壳文库,将随机突变体AAV衣壳文库在小鼠体内直接筛选,最终筛选得到高心肌靶向和低肝脏靶向的新型AAV衣壳:AAVH50与AAVH59。通过尾静脉注射,将携带的荧光素酶(Luciferase,Luc)基因递送到小鼠体内,结果表明:在检测的11个组织中,AAVH50与AAVH59在心肌组织的基因表达高于其他组织。与AAV6、AAV9相比,AAVH50与AAVH59心肌中的表达荧光素酶水平相近,肝脏中的表达明显降低AAV9。AAVH50和AAVH59感染原代新生大鼠心肌细胞后,AAVH59在心肌直接感染的效率明显高于AAV9。
  • 图 1  DNA shuffling技术构建突变体AAV衣壳文库与小鼠体内筛选。A:突变体AAV衣壳文库的建立与体内筛选流程图。B:亲本AAV和随机筛选的重组AAV克隆进行DNA酶切图,R为随机的筛选出的克隆酶切的结果。

    Figure 1.  Construction of mutant AAV capsid library by DNA shuffling technology and in vivo screening in mice.

    图 2  AAVH50与AAVH59的衣壳序列分析

    Figure 2.  Sequence analysis of the AAVH50与AAVH59 capsid

    图 3  注射AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc后小鼠荧光素酶活体成像。

    Figure 3.  In vivo imaging of mouse luciferase after injection of AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc.

    图 4  尾静脉注射AAV载体后各种小鼠组织中的荧光素酶活性

    Figure 4.  Luciferase activity in various mouse tissues after tail vein injection of AAV vector

    图 5  尾静脉注射AAV载体后各种小鼠组织中载体基因组拷贝数

    Figure 5.  Vector genome copy number in various mouse tissues after tail vein injection of AAV vector

    图 6  不同AAV载体在原代心肌细胞上的转导效率。A:AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc在PNRC细胞中荧光素酶表达情况。B:AAV6、AVV9,AAVH50,AAVH59载体转导GFP报告基因后,PNRC细胞中GFP基因表达情况,比例尺为10 μm(*代表p<0.05,**代表p<0.01)

    Figure 6.  Transduction efficiency of different AAV vectors on primary cardiomyocytes. A: AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc luciferase expression in PNRC cells. B: AAV6, AVV9, AAVH50 AAVH59 vector transduction of GFP reporter gene, GFP gene expression in PNRC cells, scale bar is 10 μm (* represents <0.05, ** represents p <0.01)

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出版历程
  • 收稿日期:  2020-03-12
  • 网络出版日期:  2020-07-22

靶向心肌组织的新型腺相关病毒载体的构建及筛选

    作者简介:陈 晨(1994-),男,甘肃省兰州市人,硕士生,主要研究方向为基因治疗。E-mail:cchenecust@163.com
    通讯作者: 郑静, zhengjing@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学药学院,上海市新药设计与研发重点实验室,上海 200237

摘要: 为了构建以心肌为靶点的基因治疗载体,通过DNA shuffling技术对选择的8种AAV(AAV1-4,AAV6-9)衣壳基因进行了重组,构建了随机突变体AAV衣壳文库,将随机突变体AAV衣壳文库在小鼠体内直接筛选,最终筛选得到高心肌靶向和低肝脏靶向的新型AAV衣壳:AAVH50与AAVH59。通过尾静脉注射,将携带的荧光素酶(Luciferase,Luc)基因递送到小鼠体内,结果表明:在检测的11个组织中,AAVH50与AAVH59在心肌组织的基因表达高于其他组织。与AAV6、AAV9相比,AAVH50与AAVH59心肌中的表达荧光素酶水平相近,肝脏中的表达明显降低AAV9。AAVH50和AAVH59感染原代新生大鼠心肌细胞后,AAVH59在心肌直接感染的效率明显高于AAV9。

English Abstract

  • 心肌病属于一组异质性心肌疾病,是导致患者过早死亡的主要原因,常见症状为心力衰竭,外周水肿,疲劳,劳累呼吸困难,阵发性夜间呼吸困难,晕厥和心脏缺血等[1-3]。常规的治疗包括使用β受体阻滞剂,血管紧张素转换酶抑制剂、手术治疗和外科治疗。但是常规的治疗方法预后不太理想,严重时更需要进行心脏移植[1,4],治疗难度大、风险高,而基因治疗的发展为心肌病持久治疗或是治愈提供了新的可能。

    腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)是目前心脏基因传递最有效的载体[5-6]。天然的AAV血清型,例如AAV1、AAV6和AAV9能够在小鼠静脉注射后转导到心肌[7-8],而AAV6直接心肌内注射最迅速,转导效率最为高效[9-10],但静脉注射会较多地转导到成年小鼠骨骼肌和肝脏中[11-12]。转导过程中AAV载体会感染其他组织,AAV6会感染较多的骨骼肌,AAV9会大量的感染肝脏,这会造成不必要的脱靶危险,所以降低其他组织的特异性十分必要[13-15]。对于特定的疾病,则需要基因载体在特定的细胞和组织中表达,在AAV载体的构建中,使用特异性启动子能够减少AAV载体全身性的表达,可避免目的基因在细胞或组织中有害的表达[16],因此,开发新的能够靶向心肌的同时减少非心肌组织感染的AAV载体,可以减少心肌病基因治疗中的副作用[17]

    AAV基因组由repcap基因以及两侧的末端重复序列(ITRs)基因构成[18]。其中rep基因编码涉及病毒复制、包装和基因组整合的非结构蛋白,而cap基因编码包括3个衣壳结构蛋白VP1、VP2和VP3 [19]。从人类和猴子中分离出的大量AAV血清型和其突变体在不同组织上表现出不同的感染性。AAV血清型特异性的主要决定于受体、辅助受体、转导效率等因素[20-21],AAV衣壳的特异性为新型AAV载体的研究和筛选打下了基础[22]。DNA shuffling技术常用来做AAV衣壳载体的改造,得到突变体AAV衣壳库可以被用来筛选理想的载体,例如低中和抗体水平[23-24]和特定组织亲和性[25]

    本研究通过DNA shuffling技术和小鼠体内筛选技术设计了心肌靶向的AAV,对AAV血清型AAV1~AAV4, AAV6~AAV9的cap基因进行了重组,构建了突变体AAV衣壳文库。根据AAV在心肌中高靶向性和肝脏中低靶向性的原则,将AAV衣壳文库在小鼠体内进行了两轮筛选,最终筛选到了AAVH50与AAVH59两种衣壳,并且对其在小鼠模型和原代大鼠新生心肌细胞(primary neonatal rat cardiomyocytes,PNRC)中进行检测,验证了其在心肌靶向性和心肌以外组织的非靶向性。

    • AAV1,AAV2,AAV3B,AAV4,AAV6,AAV7,AAV8,AAV98种天然AAV载体、pAAV-CMV-GFP、pAAV-CMV-Luc、phelper为华东理工大学新药设计与研发重点实验室保存,大肠杆菌 TOP10购于全式金生物,Taq聚合酶、T4连接酶、DNase I酶(Takara)、限制性核酸酶HindIII和NotI购于Takara公司。

      HEK293细胞为ATCC保存;胎牛血清(FBS)、DMEM培养基(Dulbecco’s modified eagle medium)、双抗(Penicillin-Streptomycin)及胰蛋白酶(0.25%)均购于Biological Industries公司;Benzonase酶购于HaiGene公司,碘克沙醇购于Sigma-Aldrich公司;C57BL/6小鼠(杰思捷实验动物)。

    • 高速离心机(日本日立,Sorvall LYNX型);台式离心机(美国Thermo Fisher,FRESCO17型)的超速离心机(美国Thermo Fisher,Sorcall WX100+型);蛋白纯化仪(美国GE,AKTA pure 150型);超净工作台(苏净安泰,SW-CJ-2FD型);PCR仪(美国ABI,Veriti DX型);qPCR仪(德国耶拿,qTOWER3G touch型);活体成像系统(上海锐珂医疗,In-vivo Multispectral System FX型);荧光显微镜(德国LEICA,DMC4500型)。酶标仪(美国bio Tek,Synergy 2型)。

    • 用AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9为PCR模板。用引物F1(5′-CCCAAGCTTCGATCATACGCAGAGAGTACCAA-3′)与R1(5′-ATAAGAATGCGGCCGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA-3′)来进行衣壳基因的扩增,并将扩增的DNA进行等比例混合,在15 ℃下,用DNaseI处理,DNA片段化后进行琼脂糖凝胶电泳、对300~1 000 bp的片段胶回收,加入DNA聚合酶变性,再退火重新组装随机衣壳基因。将产物稀释后,用DNA聚合酶和引物F1/R1来进行PCR(Polymerase Chain Reaction),PCR产物与含有ITR的AAV2衣壳质粒用HindIII和NotI进行双酶切,将PCR产物的基因与wtAAV2骨架进行连接,连接DNA产物转化到top10大肠杆菌,随机选择克隆进行单克隆培养和扩增,得到重组衣壳基因的突变体AAV质粒文库。将突变体AAV质粒文库通过使用Muller等[26]开发的包装技术,制备了多种突变体AAV衣壳,将其按相同的比例混合得到突变体AAV衣壳文库。

    • 将5×1011 vg的突变体AAV衣壳文库注射入成年C57BL/6J小鼠体内。3 d后处死小鼠,使用磷酸盐缓冲液灌流将组织中的血液去除,从心脏和肝脏组织提取DNA,用Taq聚合酶进行PCR扩增DNA,扩增后筛在心肌中出现频率较高但在肝脏中出现频率低的AAV衣壳,再将这些AAV衣壳按相同比例混合,产生二级AAV衣壳文库,再次通过小鼠尾静脉注射,用相同的方法进行了两轮体内筛选后,最终得到目的AAV衣壳。

    • 衣壳AAVH50/AAVH59/AAV9/AAV6、pAAV-CMV-Luc报告基因以及辅助质粒Phelper进行三质粒共转染HEK293细胞,从而得到AAVH50/AAVH59/AAV9/AAV6-CMV-Luc载体。将含有CMV-Luc报告基因的AAVH50、AAVH59、AAV9、AAV6载体以3×1011 vg的剂量通过尾静脉注射C57BL/6J小鼠,3×1011 vg/鼠。3周后,对注射AAVH50、AAVH59、AAV9病毒的小鼠进行活体成像。取AAVH50、AAVH59、AAV9、AAV6病毒注射的小鼠的各个组织。用荧光素酶法检测报告基因的表达。提取心脏和肝脏的总DNA,进行QPCR(Real-time Quantitative PCR)定量。

    • 衣壳AAVH50/AAVH59/AAV9/AAV6、pAAV-CMV-Luc/pAAV-CMV-GFP报告基因以及辅助质粒Phelper进行三质粒共转染HEK293细胞,从而得到AAVH50/AAVH59/AAV9/AAV6-CMV-Luc/GFP载体。将含有CMV-Luc的AAVH50,AAVH59,AAV6,AAV9载体与含有CMV-GFP的AAVH50,AAV6,AAV9载体分别感染大鼠原代心肌细胞,72 h后对细胞进行荧光素酶活性检测和荧光成像检测不同血清型介导GFP基因表达。

    • 对所有数据均进行至少3次独立实验,实验数据表示为平均值±标准差(mean±SD),并用Prism 7.0统计分析软件进行数据分析。选用T检验用于组间比较,p<0.05被认为是差异显著,p<0.01被认为是差异极显著。

    • 突变体AAV衣壳文库与小鼠体内筛选的结果如图1所示。由图1(a)可见,构建了随机AAV质粒文库后,连接到含有ITR的AAV2载体,对随机筛选的突变型AAV衣壳基因进行DNA限制性酶切分析(图1(b)),结果表明绝大多数随机筛选出的AAV衣壳基因在包装AAV衣壳可行。接下来进行了突变体AAV载体文库三质粒包装。在成年小鼠体内进行突变体AAV衣壳文库的生物筛选,尾静脉注射剂量为5×1011 的AAV衣壳文库,获取心肌肉丰富且肝脏中较少的克隆。在两轮筛选后,得到了两个名为AAVH50与AAVH59具有心肌靶向潜力的AAV衣壳。

      图  1  DNA shuffling技术构建突变体AAV衣壳文库与小鼠体内筛选。A:突变体AAV衣壳文库的建立与体内筛选流程图。B:亲本AAV和随机筛选的重组AAV克隆进行DNA酶切图,R为随机的筛选出的克隆酶切的结果。

      Figure 1.  Construction of mutant AAV capsid library by DNA shuffling technology and in vivo screening in mice.

    • 用Align X将AAVH50与AAVH59的测序结果与AAV1~AAV4、AAV6~AAV9的衣壳序列经过对比和筛选,发现AAVH50衣壳VP1的氨基酸序列由AAV1(583~736)、AAV2(1~79)、AAV3B(80~123)、AAV6(344~582)、AAV7(222~309)、AAV8(178~221)和AAV9(124~177、210~221、310~343)的衣壳部分序列组成。H59由AAV3B(1~65、262~327)、AAV6(147~261、328~735)与AAV8(66~146)衣壳的部分序列组成。图2示出了AAVH50和AAVH59衣壳的主要结构。

      图  2  AAVH50与AAVH59的衣壳序列分析

      Figure 2.  Sequence analysis of the AAVH50与AAVH59 capsid

    • C57BL/6J小鼠尾静脉注射3×1011 vg的不同AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc后,通过活体成像检测体内荧光素酶活性结果如图3所示。结果表明AAV9在小鼠肝脏中有明显的Luc基因表达,但是AAVH50和AAVH59在肝脏中的基因表达低于AAV9,并且在心脏处均有明显的基因表达,而且AAVH50在心脏处表达效果要好于AAVH59。

      图  3  注射AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc后小鼠荧光素酶活体成像。

      Figure 3.  In vivo imaging of mouse luciferase after injection of AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc.

    • 为了探究不同载体在各个组织的转导效率,小鼠尾静脉注射不同3×1011 vg/鼠的AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc后,对比了11种小鼠组织中的荧光素酶的活性,结果如图4(a)所示。结果表明在心脏、胫骨前肌、前肢、隔膜肌中,AAVH50、AAVH59的表达均低于AAV9(p<0.05)的表达,在肝脏、肺部、肾脏中AAVH50、AAVH59的表达均低于AAV9和AAV6(p<0.05)的表达,在胫骨前肌中,AAVH50的表达低于AAV6的表达(p<0.05),在腓肠肌中AAVH50表达比AAV9的表达低(p<0.01),在股肌中AAVH50的表达高于AAV6的表达(p<0.05),在脾脏中AAVH59的表达低于AAV6的表达(p<0.05),在胰脏中表达AAVH50低于AAV9(p<0.05),同时发现,与AAV6、AAV9、AAVH50相比,AAVH59在肝脏中的表达水平极低。将4种AAV的心脏与肝脏荧光素酶基因的表达进行比较,结果如图4(b)所示,AAVH50在心脏与肝脏表达的比率为17∶1,AAVH59在心脏与肝脏的表达比率为35∶1,在AAV9和AAV6中的比率为1∶2和1∶4,结果发现AAVH50与AAVH59心肝表达比显著性高于AAV6与AA9(p<0.01)。

      图  4  尾静脉注射AAV载体后各种小鼠组织中的荧光素酶活性

      Figure 4.  Luciferase activity in various mouse tissues after tail vein injection of AAV vector

      通过提取心脏和肝脏中的DNA,研究了尾静脉注射后,小鼠的心脏和肝脏中的载体基因拷贝数,结果如图5(a),AAVH59在小鼠心脏中的载体DNA的拷贝数低于AAV6的拷贝数(p<0.01),AAVH50的小鼠肝脏中的载体DNA拷贝数低于AAV9和AAV6的拷贝数(分别低169倍和30倍,p<0.01),AAVH59在肝脏拷贝数更加低于AAV9和AAV6的拷贝数(分别低55,000倍和9830,p<0.01),表明AAVH59在肝脏中的表达极低。将4种AAV的心脏与肝脏载体DNA拷贝数的进行比较(图5(b)),结果显示AAVH50的心脏与肝脏的比率高于AAV9(p<0.01)和AAV6的比率(p<0.05),AAVH59显著高于AAV9和AAV6(p<0.01),小鼠心脏肝脏比率在荧光素酶与DNA拷贝数两个方面具有相似的趋势。因此,表明了AAVH50在心脏中与AAV6和AAV9表达相近,AAVH59在心脏中表达低于AAV6表达,但两者在肝脏中的表达的均低于AAV6和AAV9表达,同时AAVH59在肝脏中的表达极低,两个新筛选出载体均在心脏有较好地表达,同时在肝脏中的表达很低。

      图  5  尾静脉注射AAV载体后各种小鼠组织中载体基因组拷贝数

      Figure 5.  Vector genome copy number in various mouse tissues after tail vein injection of AAV vector

    • 为了体外模拟直接心肌注射的效果,直接对比AAV6、AVV9、AAVH50和AAVH59在大鼠原代心肌细胞中的转导效率。如图6(a)所示,以MOI(Multiplicity of Infection)为1×104和1×103的比例加入AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAV9-CMV-Luc,荧光素酶试剂盒进行荧光素酶含量检测,发现与AAV6直接感染的效率最高,AAVH50直接感染的效率较差,AAVH59感染效率在MOI随着增加,呈现显著上升的趋势(p<0.05)。

      图  6  不同AAV载体在原代心肌细胞上的转导效率。A:AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc在PNRC细胞中荧光素酶表达情况。B:AAV6、AVV9,AAVH50,AAVH59载体转导GFP报告基因后,PNRC细胞中GFP基因表达情况,比例尺为10 μm(*代表p<0.05,**代表p<0.01)

      Figure 6.  Transduction efficiency of different AAV vectors on primary cardiomyocytes. A: AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc luciferase expression in PNRC cells. B: AAV6, AVV9, AAVH50 AAVH59 vector transduction of GFP reporter gene, GFP gene expression in PNRC cells, scale bar is 10 μm (* represents <0.05, ** represents p <0.01)

      通过GFP荧光表达情况以MOI为1×104的比例加入AAV9-CMV-GFP、AAV6-CMV-GFP、AAVH50-CMV-GFP、AAVH59-CMV-GFP感染大鼠心肌细胞,进行GFP荧光检测,结果如图6(b)所示,发现各个AAV载体的GFP荧光表达从高到低排序为AAV6,AAVH59,AAVH50和AAV9,与荧光素酶的结果呈相同的趋势。

    • 心肌疾病的基因治疗,以AAV作为基因治疗的载体具有一定的优势,AAV易于实现长期持久的心肌表达,同时AAV不能自主复制,免疫原性低,较少引发免疫反应,所以AAV载体能够具有心肌基因治疗的潜力。虽然现有的AAV6与AAV9能够有着较强的心肌表达效果[9,12],但是它们组织特异性较差,基因转导心肌的同时会转导到心肌外的其他组织,尤其是肝脏[27]。本研究尝试通过衣壳改造来解决AAV心肌特异性低的问题。

      本研究通过DNA shuffling构建了AAV衣壳基因文库,并在体内进行了直接筛选。主要优点是避免了体外筛选的偏差与局限性。为了减少AAV在肝脏的靶向性,提高体内筛选特异性,根据载体在心脏、肝脏出现的频率作为筛选依据应该是最理想和可行的策略[28]。研究结果表明:本研究成功的筛选到了心肌靶向性高且其他组织感染少的两个载体AAVH50与AAVH59。同时,AAVH50与AAV9的心肌感染方式较为类似,尾静脉注射转导心肌的效率较高,AAVH59与AAV6较为类似,直接感染具有较好心肌转导效率(图456A)。

      对比图3中Luc的活性与图4中病毒拷贝数,发现AAV9, AAV H50和AAV H59的变化趋势相同,但是AAV6的结果出现了不一致的情况,可能是由于病毒拷贝数检测使用的是qPCR定量的方法,反映的是AAV的转导情况,而Luc的活性检测则为AAV转导后的DNA表达情况,因为不同血清型AAV在小鼠体内存在差异性,导致AAV6的Luc的活性与病毒拷贝数不一致。

      图6A6B中,AAV6的Luc表达远高于AAV9、AAVH50,对比图3种的小鼠实验,可以发现,AAV9与AAVH50的值变化不大,而AAV6、AAVH59有非常明显的增加,可能是AAV6通过尾经脉注射,难以透过血管,导致在心肌中的表达受限[11]。但是在对于直接感染心肌组织,AAV6能够快速和高效的转导到啮齿动物心肌[10]。通过GFP荧光的验证,同时也证明了AAV6的直接感染心肌细胞具有较高表达,而与AAV6对比,AAV9与AAVH50则荧光信号较低。

      综上,研究发现AAVH59的性质与AAV6相类似,同时AAVH50则展现出新的特性,两个载体转导情况差异的具体机理尚不清楚,我们推测与载体组成的AAV亲本有关,AAVH50由AAV1,3B,6,7,8,9组成,AAVH59由AAV3B,6,8组成。AAV 1和6获得的衣壳片段可能在心脏纹肌的感染性方面发挥了关键作用,而AAV7和AAV8可能通过增强内皮细胞内层的转运而改善了系统基因的传递能力[29],所以AAVH50较AAVH59有较好的传递性,而AAVH59同AAV6相似,具有较直接感染性。

      最后本研究并没有能够提高心肌的转染效率,后续可以通过使用心脏特异性启动子进行AAV载体的优化,进一步增强AAVH50与AAVH59在心肌中的基因表达,为心肌疾病的基因治疗提供帮助。

(6)  参考文献 (29) 相关文章 (8)

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