下载:
-
心肌病属于一组异质性心肌疾病，是导致患者过早死亡的主要原因，常见症状为心力衰竭，外周水肿，疲劳，劳累呼吸困难，阵发性夜间呼吸困难，晕厥和心脏缺血等[1-3]。常规的治疗包括使用β受体阻滞剂，血管紧张素转换酶抑制剂、手术治疗和外科治疗。但是常规的治疗方法预后不太理想，严重时更需要进行心脏移植[1,4]，治疗难度大、风险高，而基因治疗的发展为心肌病持久治疗或是治愈提供了新的可能。
腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)是目前心脏基因传递最有效的载体[5-6]。天然的AAV血清型，例如AAV1、AAV6和AAV9能够在小鼠静脉注射后转导到心肌[7-8]，而AAV6直接心肌内注射最迅速，转导效率最为高效[9-10]，但静脉注射会较多地转导到成年小鼠骨骼肌和肝脏中[11-12]。转导过程中AAV载体会感染其他组织，AAV6会感染较多的骨骼肌，AAV9会大量的感染肝脏，这会造成不必要的脱靶危险，所以降低其他组织的特异性十分必要[13-15]。对于特定的疾病，则需要基因载体在特定的细胞和组织中表达，在AAV载体的构建中，使用特异性启动子能够减少AAV载体全身性的表达，可避免目的基因在细胞或组织中有害的表达[16]，因此，开发新的能够靶向心肌的同时减少非心肌组织感染的AAV载体，可以减少心肌病基因治疗中的副作用[17]。
AAV基因组由rep和cap基因以及两侧的末端重复序列（ITRs）基因构成[18]。其中rep基因编码涉及病毒复制、包装和基因组整合的非结构蛋白，而cap基因编码包括3个衣壳结构蛋白VP1、VP2和VP3 [19]。从人类和猴子中分离出的大量AAV血清型和其突变体在不同组织上表现出不同的感染性。AAV血清型特异性的主要决定于受体、辅助受体、转导效率等因素[20-21]，AAV衣壳的特异性为新型AAV载体的研究和筛选打下了基础[22]。DNA shuffling技术常用来做AAV衣壳载体的改造，得到突变体AAV衣壳库可以被用来筛选理想的载体，例如低中和抗体水平[23-24]和特定组织亲和性[25]。
本研究通过DNA shuffling技术和小鼠体内筛选技术设计了心肌靶向的AAV，对AAV血清型AAV1~AAV4, AAV6~AAV9的cap基因进行了重组，构建了突变体AAV衣壳文库。根据AAV在心肌中高靶向性和肝脏中低靶向性的原则，将AAV衣壳文库在小鼠体内进行了两轮筛选，最终筛选到了AAVH50与AAVH59两种衣壳，并且对其在小鼠模型和原代大鼠新生心肌细胞（primary neonatal rat cardiomyocytes，PNRC）中进行检测，验证了其在心肌靶向性和心肌以外组织的非靶向性。
-
AAV1，AAV2，AAV3B，AAV4，AAV6，AAV7，AAV8，AAV98种天然AAV载体、pAAV-CMV-GFP、pAAV-CMV-Luc、phelper为华东理工大学新药设计与研发重点实验室保存，大肠杆菌 TOP10购于全式金生物，Taq聚合酶、T4连接酶、DNase I酶（Takara）、限制性核酸酶HindIII和NotI购于Takara公司。
HEK293细胞为ATCC保存；胎牛血清（FBS）、DMEM培养基（Dulbecco’s modified eagle medium）、双抗（Penicillin-Streptomycin）及胰蛋白酶（0.25%）均购于Biological Industries公司；Benzonase酶购于HaiGene公司，碘克沙醇购于Sigma-Aldrich公司；C57BL/6小鼠（杰思捷实验动物）。
-
高速离心机（日本日立，Sorvall LYNX型）；台式离心机（美国Thermo Fisher，FRESCO17型）的超速离心机（美国Thermo Fisher，Sorcall WX100+型）；蛋白纯化仪（美国GE，AKTA pure 150型）；超净工作台（苏净安泰，SW-CJ-2FD型）；PCR仪（美国ABI，Veriti DX型）；qPCR仪（德国耶拿，qTOWER3G touch型）；活体成像系统（上海锐珂医疗，In-vivo Multispectral System FX型）；荧光显微镜（德国LEICA，DMC4500型）。酶标仪（美国bio Tek，Synergy 2型）。
-
用AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9为PCR模板。用引物F1（5′-CCCAAGCTTCGATCATACGCAGAGAGTACCAA-3′）与R1（5′-ATAAGAATGCGGCCGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA-3′）来进行衣壳基因的扩增，并将扩增的DNA进行等比例混合，在15 ℃下，用DNaseI处理，DNA片段化后进行琼脂糖凝胶电泳、对300~1 000 bp的片段胶回收，加入DNA聚合酶变性，再退火重新组装随机衣壳基因。将产物稀释后，用DNA聚合酶和引物F1/R1来进行PCR（Polymerase Chain Reaction），PCR产物与含有ITR的AAV2衣壳质粒用HindIII和NotI进行双酶切，将PCR产物的基因与wtAAV2骨架进行连接，连接DNA产物转化到top10大肠杆菌，随机选择克隆进行单克隆培养和扩增，得到重组衣壳基因的突变体AAV质粒文库。将突变体AAV质粒文库通过使用Muller等[26]开发的包装技术，制备了多种突变体AAV衣壳，将其按相同的比例混合得到突变体AAV衣壳文库。
-
将5×1011 vg的突变体AAV衣壳文库注射入成年C57BL/6J小鼠体内。3 d后处死小鼠，使用磷酸盐缓冲液灌流将组织中的血液去除，从心脏和肝脏组织提取DNA，用Taq聚合酶进行PCR扩增DNA，扩增后筛在心肌中出现频率较高但在肝脏中出现频率低的AAV衣壳，再将这些AAV衣壳按相同比例混合，产生二级AAV衣壳文库，再次通过小鼠尾静脉注射，用相同的方法进行了两轮体内筛选后，最终得到目的AAV衣壳。
-
衣壳AAVH50/AAVH59/AAV9/AAV6、pAAV-CMV-Luc报告基因以及辅助质粒Phelper进行三质粒共转染HEK293细胞，从而得到AAVH50/AAVH59/AAV9/AAV6-CMV-Luc载体。将含有CMV-Luc报告基因的AAVH50、AAVH59、AAV9、AAV6载体以3×1011 vg的剂量通过尾静脉注射C57BL/6J小鼠，3×1011 vg/鼠。3周后，对注射AAVH50、AAVH59、AAV9病毒的小鼠进行活体成像。取AAVH50、AAVH59、AAV9、AAV6病毒注射的小鼠的各个组织。用荧光素酶法检测报告基因的表达。提取心脏和肝脏的总DNA，进行QPCR（Real-time Quantitative PCR）定量。
-
衣壳AAVH50/AAVH59/AAV9/AAV6、pAAV-CMV-Luc/pAAV-CMV-GFP报告基因以及辅助质粒Phelper进行三质粒共转染HEK293细胞，从而得到AAVH50/AAVH59/AAV9/AAV6-CMV-Luc/GFP载体。将含有CMV-Luc的AAVH50，AAVH59，AAV6，AAV9载体与含有CMV-GFP的AAVH50，AAV6，AAV9载体分别感染大鼠原代心肌细胞，72 h后对细胞进行荧光素酶活性检测和荧光成像检测不同血清型介导GFP基因表达。
-
对所有数据均进行至少3次独立实验，实验数据表示为平均值±标准差（mean±SD），并用Prism 7.0统计分析软件进行数据分析。选用T检验用于组间比较，p<0.05被认为是差异显著，p<0.01被认为是差异极显著。
-
突变体AAV衣壳文库与小鼠体内筛选的结果如图1所示。由图1（a）可见，构建了随机AAV质粒文库后，连接到含有ITR的AAV2载体，对随机筛选的突变型AAV衣壳基因进行DNA限制性酶切分析(图1（b）)，结果表明绝大多数随机筛选出的AAV衣壳基因在包装AAV衣壳可行。接下来进行了突变体AAV载体文库三质粒包装。在成年小鼠体内进行突变体AAV衣壳文库的生物筛选，尾静脉注射剂量为5×1011 的AAV衣壳文库，获取心肌肉丰富且肝脏中较少的克隆。在两轮筛选后，得到了两个名为AAVH50与AAVH59具有心肌靶向潜力的AAV衣壳。
图 1 DNA shuffling技术构建突变体AAV衣壳文库与小鼠体内筛选。A：突变体AAV衣壳文库的建立与体内筛选流程图。B：亲本AAV和随机筛选的重组AAV克隆进行DNA酶切图，R为随机的筛选出的克隆酶切的结果。
Figure 1. Construction of mutant AAV capsid library by DNA shuffling technology and in vivo screening in mice.
-
用Align X将AAVH50与AAVH59的测序结果与AAV1~AAV4、AAV6~AAV9的衣壳序列经过对比和筛选，发现AAVH50衣壳VP1的氨基酸序列由AAV1(583~736)、AAV2(1~79)、AAV3B(80~123)、AAV6(344~582)、AAV7(222~309)、AAV8(178~221)和AAV9(124~177、210~221、310~343)的衣壳部分序列组成。H59由AAV3B(1~65、262~327)、AAV6(147~261、328~735)与AAV8(66~146)衣壳的部分序列组成。图2示出了AAVH50和AAVH59衣壳的主要结构。
图 2 AAVH50与AAVH59的衣壳序列分析
Figure 2. Sequence analysis of the AAVH50与AAVH59 capsid
-
C57BL/6J小鼠尾静脉注射3×1011 vg的不同AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc后，通过活体成像检测体内荧光素酶活性结果如图3所示。结果表明AAV9在小鼠肝脏中有明显的Luc基因表达，但是AAVH50和AAVH59在肝脏中的基因表达低于AAV9，并且在心脏处均有明显的基因表达，而且AAVH50在心脏处表达效果要好于AAVH59。
图 3 注射AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc后小鼠荧光素酶活体成像。
Figure 3. In vivo imaging of mouse luciferase after injection of AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc.
-
为了探究不同载体在各个组织的转导效率，小鼠尾静脉注射不同3×1011 vg/鼠的AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc后，对比了11种小鼠组织中的荧光素酶的活性，结果如图4（a）所示。结果表明在心脏、胫骨前肌、前肢、隔膜肌中，AAVH50、AAVH59的表达均低于AAV9（p<0.05）的表达，在肝脏、肺部、肾脏中AAVH50、AAVH59的表达均低于AAV9和AAV6（p<0.05）的表达，在胫骨前肌中，AAVH50的表达低于AAV6的表达（p<0.05），在腓肠肌中AAVH50表达比AAV9的表达低（p<0.01），在股肌中AAVH50的表达高于AAV6的表达（p<0.05），在脾脏中AAVH59的表达低于AAV6的表达（p<0.05），在胰脏中表达AAVH50低于AAV9（p<0.05），同时发现，与AAV6、AAV9、AAVH50相比，AAVH59在肝脏中的表达水平极低。将4种AAV的心脏与肝脏荧光素酶基因的表达进行比较，结果如图4（b）所示，AAVH50在心脏与肝脏表达的比率为17∶1，AAVH59在心脏与肝脏的表达比率为35∶1，在AAV9和AAV6中的比率为1∶2和1∶4，结果发现AAVH50与AAVH59心肝表达比显著性高于AAV6与AA9（p<0.01）。
图 4 尾静脉注射AAV载体后各种小鼠组织中的荧光素酶活性
Figure 4. Luciferase activity in various mouse tissues after tail vein injection of AAV vector
通过提取心脏和肝脏中的DNA，研究了尾静脉注射后，小鼠的心脏和肝脏中的载体基因拷贝数，结果如图5（a），AAVH59在小鼠心脏中的载体DNA的拷贝数低于AAV6的拷贝数（p<0.01），AAVH50的小鼠肝脏中的载体DNA拷贝数低于AAV9和AAV6的拷贝数（分别低169倍和30倍，p<0.01），AAVH59在肝脏拷贝数更加低于AAV9和AAV6的拷贝数（分别低55,000倍和9830，p<0.01），表明AAVH59在肝脏中的表达极低。将4种AAV的心脏与肝脏载体DNA拷贝数的进行比较（图5（b）），结果显示AAVH50的心脏与肝脏的比率高于AAV9（p<0.01）和AAV6的比率（p<0.05），AAVH59显著高于AAV9和AAV6（p<0.01），小鼠心脏肝脏比率在荧光素酶与DNA拷贝数两个方面具有相似的趋势。因此，表明了AAVH50在心脏中与AAV6和AAV9表达相近，AAVH59在心脏中表达低于AAV6表达，但两者在肝脏中的表达的均低于AAV6和AAV9表达，同时AAVH59在肝脏中的表达极低，两个新筛选出载体均在心脏有较好地表达，同时在肝脏中的表达很低。
图 5 尾静脉注射AAV载体后各种小鼠组织中载体基因组拷贝数
Figure 5. Vector genome copy number in various mouse tissues after tail vein injection of AAV vector
-
为了体外模拟直接心肌注射的效果，直接对比AAV6、AVV9、AAVH50和AAVH59在大鼠原代心肌细胞中的转导效率。如图6（a）所示，以MOI（Multiplicity of Infection）为1×104和1×103的比例加入AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAV9-CMV-Luc，荧光素酶试剂盒进行荧光素酶含量检测，发现与AAV6直接感染的效率最高，AAVH50直接感染的效率较差，AAVH59感染效率在MOI随着增加，呈现显著上升的趋势（p<0.05）。
图 6 不同AAV载体在原代心肌细胞上的转导效率。A：AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc在PNRC细胞中荧光素酶表达情况。B：AAV6、AVV9，AAVH50，AAVH59载体转导GFP报告基因后，PNRC细胞中GFP基因表达情况，比例尺为10 μm（*代表p<0.05，**代表p<0.01）
Figure 6. Transduction efficiency of different AAV vectors on primary cardiomyocytes. A: AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc luciferase expression in PNRC cells. B: AAV6, AVV9, AAVH50 AAVH59 vector transduction of GFP reporter gene, GFP gene expression in PNRC cells, scale bar is 10 μm (* represents <0.05, ** represents p <0.01)
通过GFP荧光表达情况以MOI为1×104的比例加入AAV9-CMV-GFP、AAV6-CMV-GFP、AAVH50-CMV-GFP、AAVH59-CMV-GFP感染大鼠心肌细胞，进行GFP荧光检测，结果如图6（b）所示，发现各个AAV载体的GFP荧光表达从高到低排序为AAV6，AAVH59，AAVH50和AAV9，与荧光素酶的结果呈相同的趋势。
-
心肌疾病的基因治疗，以AAV作为基因治疗的载体具有一定的优势，AAV易于实现长期持久的心肌表达，同时AAV不能自主复制，免疫原性低，较少引发免疫反应，所以AAV载体能够具有心肌基因治疗的潜力。虽然现有的AAV6与AAV9能够有着较强的心肌表达效果[9,12]，但是它们组织特异性较差，基因转导心肌的同时会转导到心肌外的其他组织，尤其是肝脏[27]。本研究尝试通过衣壳改造来解决AAV心肌特异性低的问题。
本研究通过DNA shuffling构建了AAV衣壳基因文库，并在体内进行了直接筛选。主要优点是避免了体外筛选的偏差与局限性。为了减少AAV在肝脏的靶向性，提高体内筛选特异性，根据载体在心脏、肝脏出现的频率作为筛选依据应该是最理想和可行的策略[28]。研究结果表明：本研究成功的筛选到了心肌靶向性高且其他组织感染少的两个载体AAVH50与AAVH59。同时，AAVH50与AAV9的心肌感染方式较为类似，尾静脉注射转导心肌的效率较高，AAVH59与AAV6较为类似，直接感染具有较好心肌转导效率（图4、5、6A）。
对比图3中Luc的活性与图4中病毒拷贝数，发现AAV9, AAV H50和AAV H59的变化趋势相同，但是AAV6的结果出现了不一致的情况，可能是由于病毒拷贝数检测使用的是qPCR定量的方法，反映的是AAV的转导情况，而Luc的活性检测则为AAV转导后的DNA表达情况，因为不同血清型AAV在小鼠体内存在差异性，导致AAV6的Luc的活性与病毒拷贝数不一致。
从图6A和6B中，AAV6的Luc表达远高于AAV9、AAVH50，对比图3种的小鼠实验，可以发现，AAV9与AAVH50的值变化不大，而AAV6、AAVH59有非常明显的增加，可能是AAV6通过尾经脉注射，难以透过血管,导致在心肌中的表达受限[11]。但是在对于直接感染心肌组织，AAV6能够快速和高效的转导到啮齿动物心肌[10]。通过GFP荧光的验证，同时也证明了AAV6的直接感染心肌细胞具有较高表达，而与AAV6对比，AAV9与AAVH50则荧光信号较低。
综上，研究发现AAVH59的性质与AAV6相类似，同时AAVH50则展现出新的特性，两个载体转导情况差异的具体机理尚不清楚，我们推测与载体组成的AAV亲本有关，AAVH50由AAV1，3B，6，7，8，9组成，AAVH59由AAV3B，6，8组成。AAV 1和6获得的衣壳片段可能在心脏纹肌的感染性方面发挥了关键作用，而AAV7和AAV8可能通过增强内皮细胞内层的转运而改善了系统基因的传递能力[29]，所以AAVH50较AAVH59有较好的传递性，而AAVH59同AAV6相似，具有较直接感染性。
最后本研究并没有能够提高心肌的转染效率，后续可以通过使用心脏特异性启动子进行AAV载体的优化，进一步增强AAVH50与AAVH59在心肌中的基因表达，为心肌疾病的基因治疗提供帮助。
靶向心肌组织的新型腺相关病毒载体的构建及筛选
Novel Cardiac-tropic Adeno-associated virus (AAV) Vectors Generated by DNA Shuffling and in vivo Screening
-
摘要: 为了构建以心肌为靶点的基因治疗载体，通过DNA shuffling技术对选择的8种AAV（AAV1-4，AAV6-9）衣壳基因进行了重组，构建了随机突变体AAV衣壳文库，将随机突变体AAV衣壳文库在小鼠体内直接筛选，最终筛选得到高心肌靶向和低肝脏靶向的新型AAV衣壳：AAVH50与AAVH59。通过尾静脉注射，将携带的荧光素酶（Luciferase，Luc）基因递送到小鼠体内，结果表明：在检测的11个组织中，AAVH50与AAVH59在心肌组织的基因表达高于其他组织。与AAV6、AAV9相比，AAVH50与AAVH59心肌中的表达荧光素酶水平相近，肝脏中的表达明显降低AAV9。AAVH50和AAVH59感染原代新生大鼠心肌细胞后，AAVH59在心肌直接感染的效率明显高于AAV9。
-
关键词:
- 腺相关病毒 /
- DNA shuffling /
- 体内筛选 /
- 心肌 /
- 靶向
Abstract: Cardiomyopathy is a common disease and an important cause of premature death. The development of a gene therapy vector for cardiomyopathy is the key to gene therapy of cardiomyopathy. In order to build a gene therapy vector targeting myocardium. In this study, the 8 selected AAV (AAV1-4, AAV6-9) capsid genes were recombined by DNA shuffling technology, and a random mutant AAV capsid library was constructed, and the random mutant AAV capsid library was constructed in mice Direct screening, and finally screened to obtain new AAV capsids with high myocardial targeting and low liver targeting, AAVH50 and AAVH59. Through the tail vein injection, the luciferase (Luciferase, Luc) gene carried by them was delivered to mice, and it was found that among the 11 tissues tested, the gene expression of AAVH50 and AAVH59 in myocardial tissue was higher than other tissues. Compared with AAV6 and AAV9, AAVH50 and AAVH59 expressed similar levels of luciferase in the myocardium, and the expression in the liver significantly decreased AAV9. After AAVH50 and AAVH59 infected primary neonatal rat cardiomyocytes, it was found that the efficiency of the selected AAVH59 in direct myocardial infection was significantly higher than that of AAV9. Therefore, this study screened to obtain a new type of AAV vector with high targeting to myocardium, and to the liver and low targeting, which is expected to provide a new type of AAV vector for gene therapy of myocardial diseases.-
Key words:
- DNA shuffling /
- Adeno-associated virus /
- in vivo screening /
- cardiac muscle /
- targeting
-
图 1 DNA shuffling技术构建突变体AAV衣壳文库与小鼠体内筛选。A：突变体AAV衣壳文库的建立与体内筛选流程图。B：亲本AAV和随机筛选的重组AAV克隆进行DNA酶切图，R为随机的筛选出的克隆酶切的结果。
Figure 1. Construction of mutant AAV capsid library by DNA shuffling technology and in vivo screening in mice.
图 3 注射AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc后小鼠荧光素酶活体成像。
Figure 3. In vivo imaging of mouse luciferase after injection of AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc.
图 4 尾静脉注射AAV载体后各种小鼠组织中的荧光素酶活性
Figure 4. Luciferase activity in various mouse tissues after tail vein injection of AAV vector
图 5 尾静脉注射AAV载体后各种小鼠组织中载体基因组拷贝数
Figure 5. Vector genome copy number in various mouse tissues after tail vein injection of AAV vector
图 6 不同AAV载体在原代心肌细胞上的转导效率。A：AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc在PNRC细胞中荧光素酶表达情况。B：AAV6、AVV9，AAVH50，AAVH59载体转导GFP报告基因后，PNRC细胞中GFP基因表达情况，比例尺为10 μm（*代表p<0.05，**代表p<0.01）
Figure 6. Transduction efficiency of different AAV vectors on primary cardiomyocytes. A: AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc luciferase expression in PNRC cells. B: AAV6, AVV9, AAVH50 AAVH59 vector transduction of GFP reporter gene, GFP gene expression in PNRC cells, scale bar is 10 μm (* represents <0.05, ** represents p <0.01)
-
[1] MARON M S, OLIVOTTO I, ZENOVICH A G, et al. Hypertrophic Cardiomyopathy Is Predominantly a Disease of Left Ventricular Outflow Tract Obstruction[J]. Circulation, 2006, 114(21): 2232-2239. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.106.644682 [2] LUK A, AHN E, SOOR G S, et al. Dilated Cardiomyopathy: A Review[J]. Journal of Clinical Pathology, 2009, 62(3): 219-225. doi: 10.1136/jcp.2008.060731 [3] NIHOYANNOPOULOS P, DAWSON D. Restrictive Cardiomyopathies[J]. European Journal of Echocardiography, 2009, 10(8): iii23-33. [4] ARGULIAN E, SHERRID M V, MESSERLI F H. Misconceptions and Facts About Hypertrophic Cardiomyopathy[J]. The American Journal of Medicine, 2016, 129(2): 148-152. doi: 10.1016/j.amjmed.2015.07.035 [5] XIAO X, LI J, SAMULSKI R J. Efficient Long-Term Gene Transfer into Muscle Tissue of Immunocompetent Mice by Adeno-Associated Virus Vector[J]. Journal of Virology, 1996, 70(11): 8098-8108. doi: 10.1128/JVI.70.11.8098-8108.1996 [6] NASO M F, TOMKOWICZ B, PERRY W L, et al. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy[J]. Biodrugs, 2017, 31(4): 317-334. doi: 10.1007/s40259-017-0234-5 [7] GREGOREVIC P, ALLEN J M, MINAMI E, et al. RAAV6-Microdystrophin Preserves Muscle Function and Extends Lifespan in Severely Dystrophic Mice[J]. Nature Medicine, 2006, 12(7): 787-789. doi: 10.1038/nm1439 [8] PACAK C A, MAH C S, THATTALIYATH B D, et al. Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 9 Leads to Preferential Cardiac Transduction in Vivo[J]. Circulation Research, 2006, 99(4): E3-E9. [9] SU H, HUANG Y, TAKAGAWA J, et al. AAV Serotype-1 Mediates Early Onset of Gene Expression in Mouse Hearts and Results in Better Therapeutic Effect[J]. Gene Therapy, 2006, 13(21): 1495-1502. doi: 10.1038/sj.gt.3302787 [10] PALOMEQUE J, CHEMALY E R, COLOSI P, et al. Efficiency of Eight Different AAV Serotypes in Transducing Rat Myocardium in Vivo[J]. Gene Therapy, 2007, 14(13): 989-997. doi: 10.1038/sj.gt.3302895 [11] GREGOREVIC P, BLANKINSHIP M J, ALLEN J M, et al. Systemic Delivery of Genes to Striated Muscles Using Adeno-Associated Viral Vectors[J]. Nature Medicine, 2004, 10(8): 828-834. doi: 10.1038/nm1085 [12] RENGO G, LYMPEROPOULOS A, ZINCARELLI C, et al. Myocardial Adeno-Associated Virus Serotype 6-Betaarkct Gene Therapy Improves Cardiac Function and Normalizes the Neurohormonal Axis in Chronic Heart Failure[J]. Circulation, 2009, 119(1): 89-98. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.108.803999 [13] BISH L T, MORINE K, SLEEPER M M, et al. Adeno-Associated Virus (AAV) Serotype 9 Provides Global Cardiac Gene Transfer Superior to AAV1, AAV6, AAV7, and AAV8 in the Mouse and Rat[J]. Human Gene Therapy, 2008, 19(12): 1359-1368. doi: 10.1089/hum.2008.123 [14] INAGAKI K, FUESS S, STORM T A, et al. Robust Systemic Transduction with AAV9 Vectors in Mice: Efficient Global Cardiac Gene Transfer Superior to That of AAV8[J]. Molecular Therapy, 2006, 14(1): 45-53. doi: 10.1016/j.ymthe.2006.03.014 [15] WANG L, CAO O, SWALM B, et al. Major Role of Local Immune Responses in Antibody Formation to Factor IX in AAV Gene Transfer[J]. Gene Therapy, 2005, 12(19): 1453-1464. doi: 10.1038/sj.gt.3302539 [16] COLELLA P, SELLIER P, COSTA VERDERA H, et al. AAV Gene Transfer with Tandem Promoter Design Prevents Anti-Transgene Immunity and Provides Persistent Efficacy in Neonate Pompe Mice[J]. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development, 2019, 12: 85-101. [17] CALCEDO R, MORIZONO H, WANG L, et al. Adeno-Associated Virus Antibody Profiles in Newborns, Children, and Adolescents[J]. Clinical and Vaccine Immunology, 2011, 18(9): 1586-1588. doi: 10.1128/CVI.05107-11 [18] BARTEL M A, WEINSTEIN J R, SCHAFFER D V. Directed Evolution of Novel Adeno-Associated Viruses for Therapeutic Gene Delivery[J]. Gene Therapy, 2012, 19(6): 694-700. doi: 10.1038/gt.2012.20 [19] SONNTAG F, SCHMIDT K, KLEINSCHMIDT J A. A Viral Assembly Factor Promotes AAV2 Capsid Formation in the Nucleolus[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107(22): 10220-10225. doi: 10.1073/pnas.1001673107 [20] NAM H J, LANE M D, PADRON E, et al. Structure of Adeno-Associated Virus Serotype 8, a Gene Therapy Vector[J]. Journal of Virology, 2007, 81(22): 12260-12271. doi: 10.1128/JVI.01304-07 [21] MIYAKE K, MIYAKE N, YAMAZAKI Y, et al. Serotype-Independent Method of Recombinant Adeno-Associated Virus (AAV) Vector Production and Purification[J]. Journal of Nippon Medical School, 2012, 79(6): 394-402. doi: 10.1272/jnms.79.394 [22] GOVINDASAMY L, PADRON E, MCKENNA R, et al. Structurally Mapping the Diverse Phenotype of Adeno-Associated Virus Serotype 4[J]. Journal of Virology, 2006, 80(23): 11556-11570. doi: 10.1128/JVI.01536-06 [23] GRIMM D, LEE J S, WANG L, et al. In Vitro and in Vivo Gene Therapy Vector Evolution Via Multispecies Interbreeding and Retargeting of Adeno-Associated Viruses[J]. Journal of Virology, 2008, 82(12): 5887-5911. doi: 10.1128/JVI.00254-08 [24] WANG M, CROSBY A, HASTIE E, et al. Prediction of Adeno-Associated Virus Neutralizing Antibody Activity for Clinical Application[J]. Gene Therapy, 2015, 22(12): 984-992. doi: 10.1038/gt.2015.69 [25] KIENLE E, SENIS E, BORNER K, et al. Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors Via DNA Family Shuffling[J]. Journal of Visualized Experiments, 2012(62). [26] MULLER O J, KAUL F, WEITZMAN M D, et al. Random Peptide Libraries Displayed on Adeno-Associated Virus to Select for Targeted Gene Therapy Vectors[J]. Nature Biotechnology, 2003, 21(9): 1040-1046. doi: 10.1038/nbt856 [27] ZIEGLER T, ISHIKAWA K, HINKEL R, et al. Translational Aspects of Adeno-Associated Virus-Mediated Cardiac Gene Therapy[J]. Human Gene Therapy, 2018, 29(12): 1341-1351. doi: 10.1089/hum.2017.229 [28] MAHESHRI N, KOERBER J T, KASPAR B K, et al. Directed Evolution of Adeno-Associated Virus Yields Enhanced Gene Delivery Vectors[J]. Nature Biotechnology, 2006, 24(2): 198-204. doi: 10.1038/nbt1182 [29] YANG L, JIANG J, DROUIN L M, et al. A Myocardium Tropic Adeno-Associated Virus (AAV) Evolved by DNA Shuffling and in Vivo Selection[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(10): 3946-3951. doi: 10.1073/pnas.0813207106 -
点击查看大图
图(6)
计量
- 文章访问数: 76
- HTML全文浏览量: 54
- PDF下载量: 0
- 被引次数: 0