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  • ISSN 1006-3080
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pH/光双敏感含偶氮苯聚合物分子的设计及药物载体的应用

    作者简介: 刘天奇(1994-),男,硕士生,主要研究方向为智能型纳米药物载体。E-mail:575543407@qq.com;
    通讯作者: 徐首红, xushouhong@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: O69

Design and Drug Carrier Application of a Photo-Responsive and pH-Sensitive Azobenzene Polymer Molecule

    Corresponding author: XU Shouhong, xushouhong@ecust.edu.cn ;
  • CLC number: O69

  • 摘要: 采用原子转移自由基聚合(ATRP)法合成了一系列具有pH/光双敏感的两亲性嵌段聚合物C10-偶氮苯(AZO)-C10-聚甲基丙烯酸二异丙胺基乙酯(PDPAn)-聚乙二醇(PEG45)(n=30,50,80),用核磁、凝胶渗透色谱(GPC)对合成的聚合物进行表征,用动态光散射(DLS)测定聚合物自组装形成的胶束的粒径及电位,用紫外分光光度计测定聚合物的光敏感性以及聚合物胶束的pH敏感点,采用荧光分光光度计测定聚合物胶束的临界胶束浓度(CMC),模拟体外阿霉素释药。结果表明,合成的聚合物具有良好的pH敏感性和紫外可见光敏感性,并可以自组装得到粒径约为140~200 nm的均一、稳定的球状胶束,pH敏感点在6.3~7.2之间,并且在波长为365 nm和470 nm的两种光线下发生顺反结构的转变。选择pH敏感点在6.3左右的聚合物胶束运载抗癌药物阿霉素,后续体外释药实验表明聚合物胶束在pH或光刺激下可以很好地实现可控性释药,同时利用细胞毒性实验验证了聚合物胶束具有很低的细胞毒性,该聚合物有望成为一种潜在的pH/光响应型靶向药物载体。
  • 图 FIG. 580.  FIG. 580.

    Figure FIG. 580..  FIG. 580.

    图 1  嵌段聚合物合成路线

    Figure 1.  Synthesis route of C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 block copolymer

    图 2  (Ⅰ) C10-AZO-C10-OBr、(Ⅱ) C10-AZO-C10-PDPAn 和(Ⅲ) C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45在CDCl3中的1H-NMR谱图

    Figure 2.  1H-NMR spectra of (Ⅰ) C10-AZO-C10-OBr, (Ⅱ) C10-AZO-C10-PDPAn and (Ⅲ) C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 in CDCl3

    图 3  不同pH环境下聚合物胶束溶液的(a)透射率及(b)Zeta电位的变化(聚合物胶束溶液质量浓度0.1 mg/mL)

    Figure 3.  (a) Transmittance and (b) Zeta potential of polymeric micelle solution in different pH environments(Mass concentration of copolymeric micelle solution: 0.1 mg/mL)

    图 4  反式 (a) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (c) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45, (e) C10–AZO-C10-PDPA80-mPEG45受到不同时间紫外光(365 nm)照射后的紫外吸收谱图; 顺式 (b) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (d) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45, (f) C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG45受不同时间可见光(470 nm)照射后的紫外吸收谱图

    Figure 4.  Ultraviolet absorption spectra after irradiation of ultraviolet (365 nm) after different time intervals of trans-(a) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (c) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45, (e) C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG45; Ultraviolet absorption spectra after irradiation of visible light (470 nm) after different time intervals of cis-(b) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (d) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45, (f) C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG45

    图 5  (a)聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45n=30,50,80)的临界胶束浓度随荧光强度比值I373/I384变化曲线(pH=7.4);(b)聚合物胶束的粒径分布图(pH=7.4);(c) 聚合物胶束的透射电镜图(pH=7.4)

    Figure 5.  (a) Florescence intensity ratio (I373/I384) versus logarithm of critical micelles concentrations(C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45n=30,50,80)); (b) Size distribution of the copolymer micelles; (c) Transmission electron micrographs of copolymer micelles (pH=7.4)

    图 6  聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45在不同pH和紫外光照射条件下的累计释放曲线

    Figure 6.  Accumulated release curves of C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45 in different pH under irradiation of UV light

    图 7  不同质量浓度的聚合物空白胶束对Huh7和 HEK-293T的细胞毒性

    Figure 7.  Cytotoxicity to Huh7 and HEK-293T cells at different massconcentrations of copolymer micelle

    表 1  C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45共聚物的分子量和分散系数

    Table 1.  Molecular weight and dispersity index(PDI) of C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 copolymers

    CopolymerMn,NMRMn,GPCPDI
    C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45889497481.73
    C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG4513160113551.82
    C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG4519560225241.63
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-12-27
  • 网络出版日期:  2020-09-21
  • 刊出日期:  2021-04-30

pH/光双敏感含偶氮苯聚合物分子的设计及药物载体的应用

    作者简介:刘天奇(1994-),男,硕士生,主要研究方向为智能型纳米药物载体。E-mail:575543407@qq.com
    通讯作者: 徐首红, xushouhong@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学上海多级结构纳米材料工程技术研究中心,化学与分子工程学院,上海 200237

摘要: 采用原子转移自由基聚合(ATRP)法合成了一系列具有pH/光双敏感的两亲性嵌段聚合物C10-偶氮苯(AZO)-C10-聚甲基丙烯酸二异丙胺基乙酯(PDPAn)-聚乙二醇(PEG45)(n=30,50,80),用核磁、凝胶渗透色谱(GPC)对合成的聚合物进行表征,用动态光散射(DLS)测定聚合物自组装形成的胶束的粒径及电位,用紫外分光光度计测定聚合物的光敏感性以及聚合物胶束的pH敏感点,采用荧光分光光度计测定聚合物胶束的临界胶束浓度(CMC),模拟体外阿霉素释药。结果表明,合成的聚合物具有良好的pH敏感性和紫外可见光敏感性,并可以自组装得到粒径约为140~200 nm的均一、稳定的球状胶束,pH敏感点在6.3~7.2之间,并且在波长为365 nm和470 nm的两种光线下发生顺反结构的转变。选择pH敏感点在6.3左右的聚合物胶束运载抗癌药物阿霉素,后续体外释药实验表明聚合物胶束在pH或光刺激下可以很好地实现可控性释药,同时利用细胞毒性实验验证了聚合物胶束具有很低的细胞毒性,该聚合物有望成为一种潜在的pH/光响应型靶向药物载体。

English Abstract

  • 两亲性嵌段聚合物在水溶液中能够自组装形成内核疏水、外壳亲水的聚合物胶束[1-4],因此,聚合物胶束是最早被应用的聚合物自组装体之一。过去几十年里,聚合物胶束作为药物载体在生物医药领域受到了极大的关注。比起传统药物载体,聚合物胶束能够增强药物溶解性,延长药物在血液中的循环时间,改善EPR(Enhanced Permeability and Retention)效应引起的药代动力学和药效等[5-14]。EPR效应是指肿瘤的高通透性和滞留效应,是由实体瘤的血管结构缺陷造成的,使得大分子药物可以有效转运到肿瘤组织中,从而提高了药物作用效率。不仅如此,通过改变聚合物单体、聚合度、体系结构以及其他一些参数还能够方便地调节聚合物胶束的物理化学性质。

    为了实现药物的靶向输送和可控释放,各种能够响应环境刺激如pH[15-16]、温度[17-18]、光[19-20]、氧化还原电位[21-22]、超声波[23-24]、酶[25]等的刺激响应型聚合物胶束被不断发展起来。由于肿瘤细胞的恶性增殖、营养缺乏导致糖酵解和乳酸积累,使肿瘤部位具有不同于正常组织的pH值,如相比于正常的组织环境(pH=7.2~7.4),肿瘤组织的pH为6.4左右,并且肿瘤细胞内从早期核内体(pH=6.0~6.5),晚期核内体(pH=5.0~6.0)到溶酶体(pH=4.5~5.0)也存在着pH梯度变化,所以pH刺激常被作为设计刺激响应型药物载体的内源刺激[26-28]。聚甲基丙烯酸二异丙胺基乙酯(PDPA)就是能够响应pH刺激的聚合物,在不同的pH环境下能够发生质子化或去质子化,从而使亲疏水性发生改变。光是一种非接触式的外源刺激,波长和强度都能够被远程控制,也常被应用于药物载体的设计中。偶氮苯(AZO)是光响应型的官能团,偶氮苯分子存在顺式和反式两种异构体,在紫外或可见光照射下能够发生可逆的光异构化反应,从而引起空间结构或亲疏水性的变化[29-32]

    多重刺激响应型聚合物能够对两种或多种刺激敏感,能够适应肿瘤部位复杂的生理环境,在癌症的药物递送和治疗中显示出了巨大的潜能。本文设计、合成了3种具有不同聚合度的pH和光双重敏感的聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-聚乙二醇(PEG45)(n=30,50,80),并探究聚合物的双重敏感性以及聚合物形成的胶束的基本性质,进而筛选出适合肿瘤部位药物递送的聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-PEG45,研究此聚合物包载抗癌药物阿霉素的体外释放行为以及其生物相容性。

    • 甲基丙烯酸二异丙胺基乙酯(DPA,w=98%,百灵威科技有限公司);聚乙二醇单甲醚(mPEG2000, w=98%,百灵威科技有限公司);2-溴代异丁酰溴(w=98%,百灵威科技有限公司); N,N,N',N″,N″-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA, 分析纯,上海化成工业发展有限公司);CuBr(分析纯,经冰醋酸、乙醇洗涤3次,干燥后待用);芘(w=99%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司); 盐酸型阿霉素(DOX·HCl,w=98%,百灵威科技有限公司);四氢呋喃(THF,分析纯,上海泰坦试剂有限公司,使用前重蒸除水);甲醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);二氯甲烷(分析纯, 上海泰坦试剂有限公司,使用前经氢化钙处理);中性三氧化二铝(200~300目(75~48 μm),上海莲花有限公司),碱性三氧化二铝(200~300目(75~48 μm),上海莲花有限公司);人肝癌细胞株(Huh7细胞,美国菌种保藏ATCC),人肾上皮细胞系(HEK-293T,美国菌种保藏ATCC),细胞毒性试剂盒(CCK-8, 日本同仁化学研究所)、无血清培养基(DMEM, 美国Gibco公司)、热灭活胎牛血清(FBS, 美国Gibco公司)。

      动态光散射仪(DLS, Zetasizer Nano ZS90,英国马尔文公司);紫外-可见分光光度计(UV-2450,日本岛津公司);荧光分光光度计(F-4500,日本日立公司);凝胶渗透色谱仪(GPC,PL-GPC50,英国马尔文公司);透射电子显微镜(TEM,JEM-1400,日本电子株式会社);核磁共振测定仪(NMR, AVANCEⅢ 500,德国 Bruker公司);倒置显微镜(EVOS x1,美国AMG公司);荧光显微镜(EVOS FL,美国AMG公司);微孔板分光光度计(xMark Microplate Spectrophotometer,美国Bio-Rad公司)。

    • 在干燥的单口烧瓶中加入0.421 1 g C10-AZO-C10-OH(8.6×10−4 mol),用14 mL二氯甲烷溶解,在冰水浴搅拌的条件下用注射器逐滴加入300 μL三乙胺和300 μL 2-溴异丁酰溴,停止冰水浴,避光室温反应30 h。反应结束后,向反应液中加入少量活性炭,搅拌30 min进行抽滤,滤饼用二氯甲烷冲洗3遍,取滤液,用旋蒸法除去其中的二氯甲烷溶剂,得到黄色黏稠状产物。

    • 通过原子转移自由基聚合(ATRP)聚合的方法接枝聚合物。以C10-AZO-C10-OBr作为引发剂,PMDETA作为配体,CuBr作为催化剂,用MgSO4处理过的CH2Cl2作为溶剂,按照物质的量之比n(DPA)∶n(C10-AZO-C10-OBr)∶n(CuBr)∶n(PMDETA)=m∶1∶1∶1.1(m=30、50、80,合成3种PDPA链长不同的聚合物)的比例将药品分别放入Schlenk瓶中,加6 mL溶剂CH2Cl2。经过3次液氮冷冻-抽真空-溶解,在冷冻、氮气保护的条件下加催化剂CuBr,于室温避光条件下反应12 h。反应结束后,通入空气,无水无氧体系被破坏,反应停止,此时溶液呈深绿色。将反应液通过装有中性氧化铝的柱子,用THF作洗脱液除去CuBr。通过旋蒸和在冷冻的无水甲醇中沉降的方法除去溶剂以及未反应的单体DPA、配体PMDETA,收集产物,得黄色黏稠状聚合物,通过1H-NMR以及 GPC检测产物纯度。

    • 首先将1.00 g mPEG45溶解在10 mL新蒸的THF中,在冰水浴条件下,加入0.04 gNaH并反应3 h,活化PEG中的羟基,再加入新蒸的THF 溶解的C10-AZO-C10-PDPAn-Br,室温避光反应2.5 h。反应完全后旋蒸,无水甲醇沉降3次,得到黄色黏稠状产物。用1H-NMR确定产物的结构,用GPC检测聚合物的相对分子量(Mn)和分布系数(PDI)

    • 配制质量浓度为0.3 mg/mL,pH 3.0的酸性聚合物溶液C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45n=30,50,80)。用一定浓度的NaOH溶液调节溶液的pH,用DLS和紫外-可见分光光度计测定溶液在不同pH下的电位、透射率的变化,以电位或透射率值为纵坐标,pH值为横坐标作图。

    • 配制质量浓度为0.3 mg/mL,pH 3.0的酸性聚合物溶液C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45n=30,50,80),置于紫外分光光度计的比色皿中,用365 nm的紫外光每隔5 s或10 s照射(至曲线不再变化),然后再用470 nm的可见光照射至曲线不再发生变化,在此过程中实时检测溶液的紫外吸收值。

      以芘作为荧光探针测定聚合物在水溶液中的临界胶束浓度(CMC)。首先配制芘在水中的饱和溶液,然后把一定量的C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45n=30,50,80)的THF溶液置于玻璃试管中,用吹风机使THF挥发干净,然后加入2 mL 芘的饱和溶液,使聚合物芘溶液的初始质量浓度为0.2 mg/mL,接下来用芘饱和溶液不断稀释,在此过程中,设定荧光分光光度计的激发波长为334 nm,检测不同质量浓度的聚合物芘溶液在373 nm以及384 nm处的荧光强度,以荧光强度比值(I373/I384)为纵坐标,聚合物芘溶液质量浓度的对数值为横坐标作图,其突变点即为CMC值。

    • 使用溶剂挥发法制备聚合物胶束。首先配制6 mg/mL的聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45n=30,50,80)的THF溶液,取100 μL到棕色小瓶中,在搅拌下逐滴加入2 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)(1 mmol/L),继续搅拌12 h,使溶液中的THF挥干,得到质量浓度为0.3 mg/mL的胶束溶液。对于载药的聚合物胶束,在把聚合物的THF溶液转移到棕色小瓶后,加入盐酸型阿霉素(DOX·HCl)和适量三乙胺,搅拌1 h,使亲水性盐酸型阿霉素转变为疏水的DOX,以便包载在胶束的疏水核中,再逐滴加入pH 7.4的PBS缓冲溶液,使药物的最终质量浓度为0.5 mg/mL,继续搅拌12 h,用分子截留量为14 000 g/mol的透析袋透析除去未被包载的DOX。所形成聚合物胶束的粒径、电位用DLS表征,形貌特征用TEM表征。检测包裹在胶束中的DOX在480 nm处的吸收值,得到DOX的包载量(DLC)及包封率(DLE)。公式如下:

      其中:mB1为胶束中的药物质量,mg;mC1为总胶束质量,mg;mC2为总药物质量,mg。

    • 把8 mL包载DOX的C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45胶束溶液分别取1 mL装入6个透析袋中,然后分别放入装有25 mL PBS缓冲液(pH分别为5.0、6.4、7.4)的两组离心管中,其中一组预先用365 nm的紫外光照射60 s,之后把两组离心管一起放入恒温振荡箱中振荡,每隔一定时间用紫外-可见分光光度计测定离心管中缓冲液在480 nm处的紫外吸收值,从而确定药物释放量。8 mL中剩余的2 mL胶束溶液加入HCl溶液解离,用以测定胶束中包载的总药量。DOX累计释放量以I1/I2×100%表示,其中:I1为不同时间胶束中释放出DOX的紫外吸收强度;I2为胶束包载的总DOX的紫外吸收强度。

    • 人肝癌细胞系Huh7和人肾上皮细胞系HEK-293T均来自于美国ATCC细胞库,这两款细胞都在DMEM培养液中培养,培养液中同时加入100 U/mL青霉素、100 U/mL硫酸链霉素和10%(体积分数)FBS,并将细胞放在37 ℃、含5%(体积分数)二氧化碳的培养箱中培养。

      空胶束的细胞毒性:在96孔板上接种人肝癌细胞系Huh7或人肾上皮细胞系HEK-293T细胞(104个细胞/孔),培养过夜。然后加入不同质量浓度的空胶束(7.5~225 μg/mL),共孵育8 h后换成新鲜培养液再继续培养16 h,在每个孔中加入10 μL CCK-8 中的试剂,将培养板置于培养箱中孵育1 h,然后用酶标仪检测450 nm处的吸光度。

    • 嵌段聚合物的合成路线如图1所示。首先用C10-AZO-C10-OH和2-溴异丁酰溴反应合成C10-AZO-C10-OBr,然后将其作为引发剂,用ATRP法合成聚合物C10-AZO-C10-PDPAnn=30,50,80),最后接枝亲水性的mPEG2000,得到具有pH和光双重敏感的两亲性聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45n=30,50,80)。

      图  1  嵌段聚合物合成路线

      Figure 1.  Synthesis route of C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 block copolymer

      每一步合成产物的1H-NMR如图2所示,图中(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ) 分别为C10-AZO-C10-OBr,C10-AZO-C10-PDPAn和C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG451H-NMR谱图。(Ⅰ)中a处对应于AZO上苯环的特征峰,b(δ=1.96)处的峰归属于Br−C−(CH32上的质子。(Ⅱ) 中 c(δ=1.01)处的强峰归属于异丙基的甲基质子,是PDPAn的特征峰,表明了PDPAn的成功连接。(Ⅲ)中d(δ=3.63)处出现了mPEG45中重复单元−CH2CH2O−上质子的特征峰,说明mPEG45的成功修饰。综上,说明成功制备了嵌段聚合物。

      图  2  (Ⅰ) C10-AZO-C10-OBr、(Ⅱ) C10-AZO-C10-PDPAn 和(Ⅲ) C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45在CDCl3中的1H-NMR谱图

      Figure 2.  1H-NMR spectra of (Ⅰ) C10-AZO-C10-OBr, (Ⅱ) C10-AZO-C10-PDPAn and (Ⅲ) C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 in CDCl3

      同时,GPC检测结果进一步证明了嵌段聚合物的成功合成。表1列出了合成聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45n=30,50,80)的组成、数均分子量和分散系数(PDI)。从表1可以看到,随着PDPA聚合度的增加,数均分子量增大。聚合物的PDI值偏大,可能是合成聚合物时,存在少量未反应的C10-AZO-C10-PDPAn-OBr,且不溶于无水甲醇,导致PDI偏大。

      CopolymerMn,NMRMn,GPCPDI
      C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45889497481.73
      C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG4513160113551.82
      C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG4519560225241.63

      表 1  C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45共聚物的分子量和分散系数

      Table 1.  Molecular weight and dispersity index(PDI) of C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 copolymers

      通过测定嵌段聚合物在不同pH环境下的透射率和电位的变化来确定pH敏感点,结果如图3所示。当pH<5.5时,嵌段聚合物溶液澄清透明,透过率近乎100%;随着NaOH溶液的滴加,PDPA逐渐开始脱质子化,由亲水性变成疏水性,溶液逐渐变得浑浊,从而确定pH敏感点。如图3(a)所示,pH敏感点为6.3~7.2,且随着PDPA聚合度的增加,嵌段聚合物的pH敏感点略有增大。这可能是因为PDPA链段越长,其从亲水性转变为疏水性更为困难,需要更多的OH用以脱质子化。另一方面,随着pH的升高,Zeta电位开始下降,这是由于在pH<5.5时,存在大量H+,因而溶液为正电性;随着NaOH的量逐渐增多,电位由正转为负(如图3(b)所示)。Zeta电位的结果和透过率法测出的嵌段聚合物pH敏感点基本一致。

      图  3  不同pH环境下聚合物胶束溶液的(a)透射率及(b)Zeta电位的变化(聚合物胶束溶液质量浓度0.1 mg/mL)

      Figure 3.  (a) Transmittance and (b) Zeta potential of polymeric micelle solution in different pH environments(Mass concentration of copolymeric micelle solution: 0.1 mg/mL)

      嵌段聚合物的光敏感性可以通过测定聚合物溶液在不同光照下的紫外吸收值来确定。其中偶氮苯以反式(trans-)构型存在,在350 nm处有一个强的特征吸收峰,顺式(cis-)偶氮苯在440 nm处有较强的吸收峰。从图4(a)4(c)4(e)的实验结果看出,当用365 nm的紫外光照射0.3 mg/mL的各聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45n=30,50,80; pH=3)溶液时,随着光照时间的增加,350 nm处的紫外吸收值逐渐减小,440 nm处的峰值略有增高,反式构型的AZO逐步向顺式构型转变,当光照时间约为20 s以上时,紫外吸收曲线均不再发生变化,说明反式偶氮苯向顺式偶氮苯转化已达到平衡。之后再用470 nm的可见光照射,结果如图4(b)4(d)4(f)所示,在350 nm左右处的吸收峰强度逐渐增强,440 nm处的吸收峰强度逐渐减弱,顺式构型的AZO逐步向反式构型转变。实验发现3种聚合物在可见光分别照射5、10、35 s之后,顺式偶氮苯又向反式偶氮苯转化并且达到平衡,其中,C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45反异构化速度最快,表明连接较大尺寸的聚合物可能会阻碍反异构化的进行。同时,与紫外光照前相比,光照后350 nm处的吸收值有所降低,440 nm处的吸收值略有升高,表明偶氮苯不能完全回复到紫外光照前的状态,这可能是由于PDPA嵌段对AZO基团的异构化具有一定的阻碍作用[33]。以上结果说明聚合物具有可逆的光敏感性。

      图  4  反式 (a) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (c) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45, (e) C10–AZO-C10-PDPA80-mPEG45受到不同时间紫外光(365 nm)照射后的紫外吸收谱图; 顺式 (b) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (d) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45, (f) C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG45受不同时间可见光(470 nm)照射后的紫外吸收谱图

      Figure 4.  Ultraviolet absorption spectra after irradiation of ultraviolet (365 nm) after different time intervals of trans-(a) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (c) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45, (e) C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG45; Ultraviolet absorption spectra after irradiation of visible light (470 nm) after different time intervals of cis-(b) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (d) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45, (f) C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG45

    • CMC值是嵌段聚合物形成胶束最基本的物性参数。本文利用芘作为荧光探针,测得各聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45n=30,50,80)的CMC值分别为1×10−1、1×10−2、1×10−2 mg/mL(图5(a)),且随着PDPA聚合度的增加而减小。这可能是由于PDPA链长越长,形成胶束时疏水聚集能力越强,越容易形成胶束,因此CMC值越小。通过DLS、TEM表征所形成胶束的粒径以及形貌,结果如图5(b)5(c)所示,可见各聚合物形成球状且粒径分布均匀的胶束,PDPA聚合度为30、50、80的聚合物胶束平均直径分别在140、200、220 nm左右。在pH=7.4 的PBS(1 mmol/L)缓冲液中,嵌段聚合物所形成胶束的平均直径随着PDPA聚合度的增加而增大。原因可能在于PDPA疏水嵌段越长,所形成胶束疏水内核越大,胶束直径就越大。通过TEM所观察到的粒径大小和DLS的测定结果基本一致。

      图  5  (a)聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45n=30,50,80)的临界胶束浓度随荧光强度比值I373/I384变化曲线(pH=7.4);(b)聚合物胶束的粒径分布图(pH=7.4);(c) 聚合物胶束的透射电镜图(pH=7.4)

      Figure 5.  (a) Florescence intensity ratio (I373/I384) versus logarithm of critical micelles concentrations(C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45n=30,50,80)); (b) Size distribution of the copolymer micelles; (c) Transmission electron micrographs of copolymer micelles (pH=7.4)

    • 人体正常生理环境的pH约为7.4,肿瘤微环境为弱酸性,pH约为6.5,肿瘤细胞内部环境的pH更低,约为5.5~6.5[34]。本文选取了pH敏感点为6.3左右的嵌段聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45制备胶束,作为抗癌药物DOX的载体进行体外模拟释药,载药量为12.1%±1%。

      选取pH为5.0、6.4和7.4这3种pH环境进行药物释放研究。DOX的释药结果如图6所示,累计释药量随着环境pH值的降低而增大。在pH=7.4时,25 h后的累计释药量约为11.3%±4%,说明在人体正常生理环境下,聚合物胶束能够有效地包载DOX,药物泄漏量少。在pH=6.4和pH=5.0条件下,相应的DOX最终平衡累计释药量分别约为59.6%±5%,81.0%±5%。这是因为溶液酸性越强,聚合物PDPA嵌段越容易发生质子化,从疏水性逐渐变成亲水性嵌段,引起胶束结构动摇从而释放包裹在胶束疏水层内的DOX。

      图  6  聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45在不同pH和紫外光照射条件下的累计释放曲线

      Figure 6.  Accumulated release curves of C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45 in different pH under irradiation of UV light

      同时,考察了紫外光刺激后的释药效果。在开始释药前,用365 nm的紫外光照射各个pH下的载药样品,发现其释药率都增加了约10%左右。这是因为部分疏水性DOX包裹在C10-AZO-C10嵌段所形成的疏水层中,紫外光照使AZO由反式构象变为顺式构象,导致胶束的疏水层发生扰动,促进了DOX的释放。

    • 为了检测聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45胶束本身的生物相容性,分别用人肝癌细胞系Huh7和人肾上皮细胞系HEK-293T与不同质量浓度的C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45胶束共孵育8 h,然后换成新鲜培养液继续孵育16 h,用细胞毒性试剂盒(CCK-8)检测细胞的存活率。实验结果如图7所示,与不同质量浓度的空白胶束作用后这两个细胞系的细胞存活率依然很高,即使空白胶束质量浓度高达225 μg/mL,Huh7和HEK-293T细胞的存活率仍保持在90%以上,这说明聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45胶束无论是对肝癌细胞还是对正常细胞其毒性都极小,表明此聚合物胶束具有良好的生物相容性,适合作为药物载体。

      图  7  不同质量浓度的聚合物空白胶束对Huh7和 HEK-293T的细胞毒性

      Figure 7.  Cytotoxicity to Huh7 and HEK-293T cells at different massconcentrations of copolymer micelle

    • (1)利用肿瘤细胞微环境的特点,设计合成了同时具有pH响应和紫外光响应的嵌段共聚物,通过自组装过程制备pH/光可控释药载体。

      (2)首先测得了各聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45n=30,50,80)的各项物理化学性质,其CMC值分别1×10−1、1×10−2、1×10−2 mg/mL,而其粒径也在140~220 nm之间,满足EPR效应的基本要求。

      (3)嵌段聚合物在不同pH环境下表现出不同的亲、疏水性,且受到聚合物嵌段长度的影响而具有不同的pH敏感点,其敏感点在6.3~7.2之间。

      (4)通过对嵌段聚合物的紫外光响应性能考察,证实了AZO基团的顺反结构可以在365 nm的紫外光和470 nm的可见光照射下发生可逆转换,照射下具有良好的光响应性能。

      (5)验证了聚合物在水相中具有优良的pH/光双敏感可控性,通过照射可使原先pH敏感的聚合物胶束的释药率提高10%左右,而细胞毒性实验表明所获得的聚合物胶束不论是在低质量浓度(7.5 μg/mL)下还是在较高质量浓度(225 μg/mL)下都有较高的生物相容性,可以预见该pH/光双敏感的聚合物胶束在靶向药物载体研制领域具有良好的应用前景。

(8)  表(1) 参考文献 (34)

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