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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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抗生素负载型二硫化钼-糖基苝酰亚胺自组装体系构建及抗菌研究

    作者简介: 吴棒(1993—),男,硕士生,研究方向为糖基复合体系的抗菌研究。E-mail:740950366@qq.com;
    通讯作者: 胡习乐, xlhu@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: O69

Construction and Antibacterial Application of 2D MoS2-Glycoperylenediimide Antibiotic-Loading System

    Corresponding author: Xi-Le HU, xlhu@ecust.edu.cn ;
  • CLC number: O69

  • 摘要: 引入半乳糖基或甘露糖基共价缀合的苝酰亚胺化合物,并将其通过π-π堆叠作用负载在片层二硫化钼表面,进一步包载抗生素头孢他啶构建了靶向细菌的治疗体系。借助具有光敏活性的苝酰亚胺母核及二硫化钼在光照下能够释放活性氧簇实现光动力治疗细菌的效果,以此达到靶向细菌的光动力协同药物治疗效果。该自组装光动力载药治疗体系的构建大大减少了抗生素药物的使用量,降低了细菌耐药性并为临床性顽固细菌提供了新的治疗思路。
  • 图 1  苝酰亚胺糖缀合物PDI-Gal4和PDI-Man6结构

    Figure 1.  Structures of compound PDI-Gal4 and PDI-Man6

    图 2  片层MoS2和PDI-Gal4(a)和PDI-Man6(b)组装前后的粒径变化

    Figure 2.  Particle size change before and after self-assemblies of MoS2 complex with PDI-Gal4(a)and PDI-Man6(b)

    图 3  PDI-Gal4(a)和PDI-Man6(b)与MoS2组装前后的紫外-可见吸收光谱变化

    Figure 3.  Ultraviolet-visible absorption spectroscopy analysis of MoS2 complex with PDI-Gal4(a)and PDI-Man6(b)

    图 4  空白PBS(a),PDI-Gal4(b),和PDI-Gal4@MoS2(c)在白光光照下ROS释放和ROS释放量与光照时间之间的线性关系(d)

    Figure 4.  ROS release of PBS blank (a), PDI-Gal4 (b), and PDI-Gal4 @ MoS2 (c) under white light illumination, Linear relationship between ROS release and light time (d)

    图 5  空白PBS体系(a),PDI-Man6体系(b)和PDI-Man6@MoS2体系(c)的白光光照下ROS释放(MoS2:50 μg/mL,PDI-Man6:20 μM);ROS释放量与光照时间之间的线性关系(d)

    Figure 5.  ROS release of PBS blank (a), PDI-Man6 (b) and PDI-Man6@MoS2 (c) under white light illumination; Linear relationship between ROS release and light time (d)

    图 6  MoS2、PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2对于药物CAZ的负载率(a)和负载量(b)

    Figure 6.  Loading rates (a) and the quantification load (b) of MoS2, PDI-Gal4 @ MoS2 and PDI-Man6 @ MoS2 to drug CAZ

    表 1  MoS2、PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2对于药物CAZ的负载量

    Table 1.  Load of quantification MoS2、PDI-Gal4@MoS2 and PDI-Man6@MoS2 to drug CAZ

    Drug-loading systemDrug-loading
    MoS2165
    PDI-Gal4@MoS2179
    PDI-Man6@MoS2191
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    表 2  CAZ联合自组装体系对于绿脓杆菌(ATCC 27853)的MIC

    Table 2.  Determination of MIC of CAZ combined self-assembly system treatment for P. aeruginosa (ATCC 27853)

    SamplesMIC/(μg·mL−1)
    Without lightWith light
    CAZ3232
    PDI-Man6@CAZ3216
    PDI-Man6@MoS2@CAZ168
    PDI-Gal4@CAZ162
    PDI-Gal4@MoS2@CAZ161
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出版历程
  • 网络出版日期:  2020-07-16

抗生素负载型二硫化钼-糖基苝酰亚胺自组装体系构建及抗菌研究

    作者简介:吴棒(1993—),男,硕士生,研究方向为糖基复合体系的抗菌研究。E-mail:740950366@qq.com
    通讯作者: 胡习乐, xlhu@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学结构可控先进功能材料及其制备教育部重点实验室,费林加诺贝尔奖科学家联合研究中心,上海 200237

摘要: 引入半乳糖基或甘露糖基共价缀合的苝酰亚胺化合物,并将其通过π-π堆叠作用负载在片层二硫化钼表面,进一步包载抗生素头孢他啶构建了靶向细菌的治疗体系。借助具有光敏活性的苝酰亚胺母核及二硫化钼在光照下能够释放活性氧簇实现光动力治疗细菌的效果,以此达到靶向细菌的光动力协同药物治疗效果。该自组装光动力载药治疗体系的构建大大减少了抗生素药物的使用量,降低了细菌耐药性并为临床性顽固细菌提供了新的治疗思路。

English Abstract

  • 细菌耐药性如今已呈现出愈发多样化和顽固化的趋势,这为细菌的临床治疗带来了大量新的威胁和挑战[1-3]。近年来,具有抗菌药物载体性能和功能性抗菌活性的新一代材料实现了光动力/光热效应协同传统抗生素的协同抗菌效果[4-6]。光动力治疗(photodynamic therapy, PDT)中的光敏剂分子与抗生素药物一样具有共轭化学结构,能负载在自组装体系表面,通过特定波长光的敏化作用激活周边环境中的氧,激活后的高能态氧通常被称为活性氧簇(reactive oxygen species, ROS),由于其强氧化性和高能态毒性,能有效杀伤细菌。相比于传统药物治疗方法,PDT往往不易使细菌产生耐药性,也大大减少了对宿主组织的损伤[7-9]。然而,单独使用光敏剂进行PDT的劣势在于ROS半衰期较短,导致ROS易在环境中耗散,因而达不到很好的抗菌效果。出于这一原因,在构建光敏治疗载体时常常需要将光敏剂负载在材料体系表面并与少量的抗生素类药物协同作用[10-11]。功能化的石墨烯纳米材料作为药物载体已经被广泛地应用[12],负载小分子的材料能够控释或缓释光敏药物以及传统抗生素药物,从而使得所有治疗分子靶向簇集在患处,有效解决了这一问题。

    二维片层二硫化钼(MoS2)是一种具有易于制备,易于分散,稳定性好,负载载体的能力强等优点的材料[13-14]。荧光团苝酰亚胺(perylenediimide, PDI)同时也是常用的光敏剂。PDI在光辐射下可显著产生ROS从而实现PDT,且该化合物的荧光特性也可进一步被应用于疾病的光学诊断[15-16]。然而,外源性的光敏剂及功能材料往往对于人体组织有强烈的细胞毒性和促炎作用。因此,提升材料的生物相容性十分重要。糖基是能够显著改善材料亲水性的基团,还是生物体自身具有的不可或缺的生物分子。糖基的引入还能够分别降低和提高材料的细胞毒性和生物相容性。更为特异的是,糖基同时还能够作为常见的生物靶向识别基团以此来识别特定凝集素。有些细菌也和细胞同样,能够特异性分泌某种凝集素或蛋白,因此能够被特定糖所靶向识别[17-18]。例如,半乳糖基能够特异性结合绿脓杆菌表面凝集素从而识别绿脓杆菌。此外研究还发现,小分子的糖基自身对细菌的识别能力较弱,往往需要聚集起来形成糖簇结构,才能提高糖对细菌的识别效果[19]

    基于上述的背景,本文报道了两种分别修饰了半乳糖基以及甘露糖基的不同糖型PDI糖缀合物,通过π-π堆叠作用,两种PDI糖缀合物被负载在片层MoS2上构建形成糖簇自组装体系,以此构建了靶向绿脓杆菌的半乳糖光动力抗菌体系,而甘露糖的体系作为参照被证明无明显的绿脓杆菌靶向性。二硫化钼材料表面还能够进一步负载少量抗生素分子,在PDI实现靶向光动力抗菌的同时实现协同释药。该载药光动力抗菌自组装体系的构建,实现了光动力治疗协同抗生素的抗菌效果。

    • 实验中使用的绿脓杆菌(ATCC 27853)购自北京中原公司,实验中使用的有机化合物半乳糖基苝酰亚胺化合物(PDI-Gal4)和甘露糖基苝酰亚胺化合物(PDI-Man6)为已知化合物[20]。二硫化钼粉末购于上海百灵威有限公司。

    • 超净工作台购于无锡净化设备厂;Centrifuge5415D台式离心机购于Eppendorf (Hamburg, Germany)公司;电子天平购于上海舜宇恒平科学仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌器购于上海申安医疗器械厂;恒温培养箱购于OLYMPUS (Tokyo, Japan)公司;超低温冰箱购于SANYO (Osaka, Japan)公司;恒温摇床购于Forma Scentific (Marietta,USA)公司。

    • 实验中使用二硫化钼的粉末作为原料,通过超声、冻干等步骤制备得到单层或少层的二硫化钼材料:向25 mL的棕色玻璃瓶中加入20 mL的乙醇和超纯水混合溶液(体积比为1:1),然后加入100 mg的二硫化钼粉末,搅拌均匀后放入超声清洗仪中,冰浴条件下(控制温度在20 °C左右)超声12 h(功率为100 Hz),得到混合的悬浮液。使用离心机对悬浮液进行离心12 min,使用移液枪吸取离心后的上层溶液,冻干机冻干过夜,最终得到10 mg粉末状的二硫化钼(产率为10 %),将其溶于去离子水中,超声30 min得到二硫化钼分散液。

    • 糖基苝酰亚胺PDI-Gal4/PDI-Man6化合物的结构如图1所示。

      图  1  苝酰亚胺糖缀合物PDI-Gal4和PDI-Man6结构

      Figure 1.  Structures of compound PDI-Gal4 and PDI-Man6

      负载头孢他啶体系的构建步骤:取1 mL 40 μmol/L的PDI-Gal4或PDI-Man6与1 mL 100 μg/mL的二硫化钼分散溶液置入5 mL的棕色瓶中,放入超声清洗仪中进行超声30 min,得到二硫化钼与糖基化合物的自组装体系PDI-Gal4@MoS2或PDI-Man6@MoS2。进一步向自组装体系中加入256 μg/mL头孢他啶(Ceftazidime, CAZ)溶液,搅拌12 h后,离心除去未负载的药物,将底部离心物重溶于缓冲液中,得到负载头孢他啶的抗菌体系PDI-Gal4@MoS2@CAZ或PDI-Man6@MoS2@CAZ。采用动态光散射分析(DLS)和紫外可见光谱分析(UV-Vis)验证苝酰亚胺分子与二硫化钼之间是否实现成功自组装。

    • 将LB(Luria Bertani)固相培养基培养的绿脓杆菌(ATCC 27853)单菌落挑出,接种到1 mL LB 液体培养基中,设定摇床温度为37 °C并摇晃12 h过夜待菌液完全浑浊。将菌液用LB液体培养基将菌液稀释至每毫升106个细胞的浓度。

    • 糖基PDI分子中的PDI母核是有效的光敏剂,在白光的光照下能释放ROS以此杀灭细菌。二氢罗丹明123(DHR123)是一种自由基捕获剂,其本身没有显著的荧光,但却能够在ROS存在下被氧化产生荧光性罗丹明分子,从而显示出荧光,利用这种特性检测了在梯度时间光照下不同体系溶液中的ROS释放,以此验证不同体系的光敏化作用。

    • 抗菌活性测试共有:空白组,CAZ组,PDI-Man6@CAZ组,PDI-Man6@MoS2@CAZ组,PDI-Gal4@CAZ组,PDI-Gal4@MoS2@CAZ组。空白组在96孔板的一排8个孔中加入LB培养基中的绿脓杆菌菌液(浓度为每毫升菌液有106个细胞,下同)。

      对于CAZ组,在LB菌液的1排8个孔中分别加入质量浓度为128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL 的CAZ,之后重复3排验证实验准确性。对于PDI-Man6@CAZ组,在LB菌液的1排8个孔中各自加入20 μmol/L的PDI-Man6和质量浓度为128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL的CAZ,实验重复3排验证实验准确性。对于PDI-Man6@MoS2@CAZ组,含有LB菌液的1排8个孔中先是PDI-Man6@MoS2自组装体系,其中PDI-Man6浓度为20 μmol/L,MoS2质量浓度为50 μg/mL,然后加入对应的质量浓度为128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL的CAZ,实验重复3排验证实验准确性。对于半乳糖体系的PDI-Gal4@CAZ组和PDI-Gal4@MoS2@CAZ组,实验方法与用量均与上述相同。

      材料制备完成后,若需光照则在白光光照下光照40 min,若不需要光照则置于暗处,之后将孔板置于培养箱中,37 °C下培养18 h过夜,最后观察最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration, MIC)。

    • 通过π-π堆叠作用,分别将PDI-Gal4和PDI-Man6与二硫化钼片层自组装构成PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2,然后将抗生素头孢他啶(ceftazidime, CAZ)进一步负载到材料表面构成PDI-Gal4@MoS2@CAZ与PDI-Man6@MoS2@CAZ。利用白光光照条件下基于PDI母核的抗菌材料体系在载入MoS2前后的自由基释放性能验证了材料的光动力杀菌活性。利用PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2对于CAZ的负载率验证了材料负载药物的能力;最后为实际验证本文所构建的所有体系的抗菌效果,利用绿脓杆菌标准菌株且单独的抗生素及单独的自组装体系被用作为抗菌对照组,检验了白光光照下PDI-Gal4@MoS2@CAZ及PDI-Man6@MoS2@CAZ体系最小抑菌浓度。

    • 在DLS实验分析中可以看出,由于π-π堆叠作用,PDI-Gal4和PDI-Man6与二硫化钼自组装构建为PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2后,对比于单独的二硫化钼材料,自组装后体系的粒径增大(图2)。同时在UV-Vis光谱分析中,化合物PDI-Gal4和PDI-Man6的紫外吸收信号在组装成为PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2体系之后,紫外吸收峰分别在594 nm 和596 nm处发生了4~5 nm左右的红移,并伴随有微小的紫外吸收强度提升(图3),说明苝酰亚胺糖缀合物与二硫化钼材料之间通过π-π堆叠发生了自组装[21]

      图  2  片层MoS2和PDI-Gal4(a)和PDI-Man6(b)组装前后的粒径变化

      Figure 2.  Particle size change before and after self-assemblies of MoS2 complex with PDI-Gal4(a)and PDI-Man6(b)

      图  3  PDI-Gal4(a)和PDI-Man6(b)与MoS2组装前后的紫外-可见吸收光谱变化

      Figure 3.  Ultraviolet-visible absorption spectroscopy analysis of MoS2 complex with PDI-Gal4(a)and PDI-Man6(b)

    • 组装体系的ROS释放的结果如图4图5所示。根据梯度光照下的荧光信号变化能够发现,空白的PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)不会释放ROS,而单独的PDI-Gal4和PDI-Man6,以及自组装后的PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2体系则都具有显著而稳定的光敏化产生ROS的效应(图45)。值得注意的是,根据荧光谱图变化对比和定量计算观察到,当PDI-Gal4和PDI-Man6与片层二硫化钼自组装之后,PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2的ROS释放量比起单独游离的PDI-Gal4和PDI-Man6分子有所提高,表明了二维材料的负载也能够一定程度提升苝酰亚胺的PDT释放ROS的效果(图4d5d)。

      图  4  空白PBS(a),PDI-Gal4(b),和PDI-Gal4@MoS2(c)在白光光照下ROS释放和ROS释放量与光照时间之间的线性关系(d)

      Figure 4.  ROS release of PBS blank (a), PDI-Gal4 (b), and PDI-Gal4 @ MoS2 (c) under white light illumination, Linear relationship between ROS release and light time (d)

      图  5  空白PBS体系(a),PDI-Man6体系(b)和PDI-Man6@MoS2体系(c)的白光光照下ROS释放(MoS2:50 μg/mL,PDI-Man6:20 μM);ROS释放量与光照时间之间的线性关系(d)

      Figure 5.  ROS release of PBS blank (a), PDI-Man6 (b) and PDI-Man6@MoS2 (c) under white light illumination; Linear relationship between ROS release and light time (d)

    • 实验中CAZ药物被载入PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2体系后,分别测定了其药物负载能力。未负载药物总量可以通过测定PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2上清液中游离药物的UV-Vis吸收值得到,负载率及负载量结果如图6所示。抗生素头孢他啶的负载量如表1所示。实验结果表明,自组装体系PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2具有优良的负载抗生素头孢他啶的性能。

      图  6  MoS2、PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2对于药物CAZ的负载率(a)和负载量(b)

      Figure 6.  Loading rates (a) and the quantification load (b) of MoS2, PDI-Gal4 @ MoS2 and PDI-Man6 @ MoS2 to drug CAZ

      Drug-loading systemDrug-loading
      MoS2165
      PDI-Gal4@MoS2179
      PDI-Man6@MoS2191

      表 1  MoS2、PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2对于药物CAZ的负载量

      Table 1.  Load of quantification MoS2、PDI-Gal4@MoS2 and PDI-Man6@MoS2 to drug CAZ

    • 为有效治疗绿脓杆菌并且减少细菌的抗生素耐药性,研究中利用苝酰亚胺荧光母核及二维材料的光动力性质,将两种分别带有半乳糖糖基或甘露糖残基的苝酰亚胺分子通过π-π堆叠作用负载在具有优异物理性能的二维片层二硫化钼材料表面,并同时负载抗生素CAZ,构建了具有优良抗菌活性的载药光动力抗菌体系PDI-Gal4@MoS2@CAZ和PDI-Man6@MoS2@CAZ。

      PDI-Gal4@MoS2@CAZ和PDI-Man6@MoS2@CAZ对于绿脓杆菌的抗菌活性被进一步评价,这其中半乳糖体系对绿脓杆菌具有靶向性,而甘露糖体系作为参照组。利用绿脓杆菌标准菌株,实验中分别测定了单独抗生素药物CAZ和负载抗生素的PDI-Gal4@MoS2@CAZ和PDI-Man6@MoS2@CAZ抗菌体系,在有无白光照射条件下的抗绿脓杆菌的活性(MIC),以验证载药体系的光动力协同药物抗菌活性的强化效果。从抗菌活性MIC结果可以看出,单独的CAZ作为传统抗生素药物对于菌有稳定抑制效果,并且药物的作用是不受到外界光源的影响的。在CAZ与PDI-Man6组装形成载药体系后,在非光照条件下,载药体系并未产生对细菌的增效杀伤效果,白光光照下,PDI化合物产生的ROS能够协同负载的药物增强治疗效果,却并未有明显靶向增效性,二硫化钼材料的引入构建形成的抗菌体系PDI-Man6@MoS2@CAZ,在该体系中,药物在二硫化钼表面的装载起到了药物递送的作用,在非光照条件下抗菌实验结果表现出抗菌增效效果,白光光照下,使得PDI-Man6@MoS2@CAZ体系将CAZ原先对于绿脓杆菌的MIC从32 μg/mL降低到8 μg/mL,将其抗菌能力提升了4倍。基于半乳糖基体系中的半乳糖基能够靶向绿脓杆菌表面分泌的蛋白LecA,实验中观察到在非光照条件下,CAZ与PDI-Gal4自组装载药体系对于绿脓杆菌的靶向效果便已经初步体现。在白光光照下,即便未与二硫化钼材料自组装,PDI-Gal4与CAZ的复合体系借助半乳糖基的靶向性将体系中CAZ对于绿脓杆菌的MIC显著降低到2 μg/mL,该结果明显区别与没有靶向性PDI-Man6@CAZ体系,负载抗生素体系PDI-Gal4@MoS2@CAZ在非光照条件下的靶向效果与游离态PDI-Gal4@CAZ相似,白光光照下,半乳糖基对绿脓杆菌的靶向作用促使药物的高选择性低损耗的装载,完成敏化ROS和药物的全方位菌内释放,使得PDI-Gal4@MoS2@CAZ体系将CAZ原先对于绿脓杆菌的MIC从32 μg/mL 降低到1 μg/mL(表2)。我们通过自组装体系携带抗生素,大幅度提高了抗生素 CAZ杀灭绿脓杆菌的效果,将其抗菌能力提升了32倍,表现出明显的增效效果。综上所述,半乳糖基的引入,不仅为抗菌材料提供了靶向基团,使之能够靶向表面具有特异性凝集素的绿脓杆菌,也进一步提升了基于二维材料体系的生物相容性。本研究为开发一类具有生物靶向性、高生物相容性等优势的抗菌材料提供了新的方向,也进一步为能够避免抗生素的使用,完全借助材料的光学性能来实现抗菌效果的自组装体系构建提供研究基础。

      SamplesMIC/(μg·mL−1)
      Without lightWith light
      CAZ3232
      PDI-Man6@CAZ3216
      PDI-Man6@MoS2@CAZ168
      PDI-Gal4@CAZ162
      PDI-Gal4@MoS2@CAZ161

      表 2  CAZ联合自组装体系对于绿脓杆菌(ATCC 27853)的MIC

      Table 2.  Determination of MIC of CAZ combined self-assembly system treatment for P. aeruginosa (ATCC 27853)

      致谢:本研究得到了法国里昂第一大学Sébastien Vidal教授的大力支持与帮助。

(6)  表(2) 参考文献 (21) 相关文章 (20)

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