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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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丹参酮IIA通过改善线粒体功能和氧化应激减轻大鼠认知障碍

    作者简介: 李洁(1995-),女,山东人,硕士生,主要研究方向为药理学。E-mail:jie_ecust@126.com;
    通讯作者: 马磊, malei@ecust.edu.cn ; 王蕊, ruiwang@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: R965

Tanshinone IIA Attenuates Cognitive Impairment via Improving Mitochondrial Function and Reducing Oxidative Stress

    Corresponding author: Lei MA, malei@ecust.edu.cn ;Rui WANG, ruiwang@ecust.edu.cn
  • CLC number: R965

  • 摘要: 通过建立双侧颈总动脉结扎(BCCAO)大鼠模型和H2O2诱导的原代星形胶质细胞的氧化损伤模型,探究丹参酮IIA(TSA)的神经保护作用和机制。TSA逆转了BCCAO诱导的大鼠认知障碍和神经元丢失,增加了皮层和海马中脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。TSA抑制了细胞活力的降低和乳酸脱氢酶(LDH)的释放。其次,TSA减弱了线粒体膜电位(MMP)的丧失,并增加了ATP水平。TSA显著逆转了由线粒体复合酶异常引起的损伤,降低了活性氧(ROS)积累和脂质过氧化水平,同时增强了抗氧化能力。本研究表明,TSA可以增强线粒体生物能并有效减轻氧化损伤,发挥神经保护作用。
  • 图 1  丹参酮IIA(TSA)的化学结构式

    Figure 1.  Chemical structure of Tanshinone IIA (TSA)

    图 2  (a)在隐藏平台试验中的大鼠潜伏期;(b)在测试阶段大鼠在目标象限的停留时间;(c)平均运动速度;(d)测试阶段代表性的游泳轨迹图

    Figure 2.  (a) Latency of rats in hidden platform trials; (b) Time spent in the target quadrant in probe test; (c) Swimming speed during the water maze test; (d) Representative swimming track in probe test (n=17)

    图 3  (a)代表性的海马尼氏染色的显微照片;(b)~(d)海马CA1,CA3,DG区(n=3)中的细胞计数

    Figure 3.  (a) Representative photomicrographs of the hippocampus; (b)~(d) quantitative cells in hippocampal CA1, CA3, DG regions (n=3)

    图 4  Western Blot检测皮层(a)和海马(b)中BDNF的定量变化;(c)和(d)分别为皮层和海马中BDNF表达的代表性条带;(e)免疫组化检测皮层和海马中BDNF的表达水平

    Figure 4.  Quantitative changes of BDNF in the cortex (a) and hippocampus (b); Representative images of BDNF expression in the cortex (c) and hippocampus (d);(e) BDNF expression in cortex and hippocampus CA1 were detected by immunohistochemistry

    图 5  (a)GFAP的免疫荧光染色;(b)通过CCK-8检测TSA作用时细胞活力;(c)通过CCK-8的测定H2O2损伤时细胞活力;(d)LDH释放检测;(e)在显微镜下观察细胞形态变化

    Figure 5.  (a) Immunofluorescent staining of the GFAP; (b) cell viability measured by CCK-8 assay after TSA treatment; (c) Cell viability and cytotoxicity were detected by the assays of CCK-8; (d) LDH release; (e) Cellular morphology changes were captured under biological microscope

    图 6  (a)H2O2损伤模型中星形胶质细胞的MMP水平变化;皮层((b),n=4)、海马((c),n=3)星形胶质细胞(d)中的ATP水平;皮层((e),n=5)和海马((f),n=3)中的复合物I活性;皮层((g),n=4)和海马((h),n=4)中的复合物IV活性

    Figure 6.  (a) MMP levels in the astrocytes with H2O2 injury; ATP levels in the cortex ((b), n=4) and hippocampus ((c), n=3), respectively; (d) ATP levels in the astrocytes with H2O2 injury; Complex I activity in the cortex ((e), n=5) and hippocampus ((f), n=3); Complex IV activity in the cortex ((g), n=4) and hippocampus ((h), n=4).

    图 7  (a)荧光显微镜拍摄ROS荧光照片;(b)ROS荧光的半定量;(c)MDA水平;(d)SOD活性;(e)GSH水平变化

    Figure 7.  (a) Photos of ROS fluorescence were captured by fluorescent microscope (scale bars: 200μm); (b) Semi-quantitation of ROS Fluorescence; (c) MDA level; (d) SOD activity; (e) GSH level were measured

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-11-28
  • 网络出版日期:  2020-01-21

丹参酮IIA通过改善线粒体功能和氧化应激减轻大鼠认知障碍

    作者简介:李洁(1995-),女,山东人,硕士生,主要研究方向为药理学。E-mail:jie_ecust@126.com
    通讯作者: 马磊, malei@ecust.edu.cn
    通讯作者: 王蕊, ruiwang@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学药学院,上海市新药设计重点实验室,上海 200237

摘要: 通过建立双侧颈总动脉结扎(BCCAO)大鼠模型和H2O2诱导的原代星形胶质细胞的氧化损伤模型,探究丹参酮IIA(TSA)的神经保护作用和机制。TSA逆转了BCCAO诱导的大鼠认知障碍和神经元丢失,增加了皮层和海马中脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。TSA抑制了细胞活力的降低和乳酸脱氢酶(LDH)的释放。其次,TSA减弱了线粒体膜电位(MMP)的丧失,并增加了ATP水平。TSA显著逆转了由线粒体复合酶异常引起的损伤,降低了活性氧(ROS)积累和脂质过氧化水平,同时增强了抗氧化能力。本研究表明,TSA可以增强线粒体生物能并有效减轻氧化损伤,发挥神经保护作用。

English Abstract

  • 目前,血管性痴呆已成为继阿尔茨海默病之后第二大常见的痴呆类型[1-2],并且有40%的病例被诊断为阿尔茨海默病混合型,表明在大多数患者中血管因素发挥了重要作用[3]。慢性脑灌注不足(CCH)是血管性痴呆发病机理中最常见的原因之一。CCH引起的脑能量代谢紊乱和氧化应激被认为是发病机理中的关键危险因素[4-5]。在缺血性疾病中,血流量的减少将导致氧气和葡萄糖输送不足以及ATP产生和消耗之间的不平衡[6]。目前,已经证明氧化应激可以产生活性氧(ROS)的恶性循环,其进一步抑制正常的电子传递,最终导致代谢失衡[7]。双侧颈总动脉结扎(BCCAO)诱发的CCH被广泛用作血管性痴呆的模型[8]

    丹参酮IIA(TSA)是从中药丹参中分离出来的活性化合物,具有心脏保护[9]、抗炎[10]、抗氧化和抗凋亡作用[11],已被广泛用作预防或治疗心脑血管疾病[12-13]的有效药物。据报道,TSA可减少大脑中动脉闭塞(MCAO)的梗塞体积并改善神经功能缺陷[14-15]。星形胶质细胞是大脑中最丰富的细胞,星形胶质细胞和神经元之间双向信号的存在也揭示了星形胶质细胞在神经系统中的重要作用[16]。星形胶质细胞为神经元提供结构和代谢支持,保护血脑屏障,提供抗氧化防御[17-18]。然而,在氧化应激中,TSA对星形胶质细胞的作用仍然未知。因此,本研究通过BCCAO动物模型、原代星形胶质细胞的氧化损伤模型探究TSA的神经保护作用和机制。

    • 2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)购自Sigma-Aldrich公司;胶质纤维酸蛋白(GFAP)购自EnCor Biotechnology;Nissl染色试剂盒,荧光二抗IgG,Hoechst33242,CCK-8检测试剂盒,LDH细胞毒性试剂盒,ATP检测试剂盒,JC-1线粒体膜电位检测试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自上海碧云天生物;丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒购自南京建成生物公司;BDNF抗体和复合物I酶活性检测试剂盒购自Abcam;二抗IgG购自Santa Cruz;ECL试剂盒购自Thermo Scientific;细胞色素氧化酶活性测定试剂盒购自BioVision公司;免疫组化中BDNF抗体,生物素标记的羊抗兔IgG,HRP标记链霉亲和素购自北京博奥森生物技术有限公司。

      多奈哌齐购自上海源叶生物科技有限公司。TSA(图1)由华东理工大学药学院的马磊课题组提供。

      图  1  丹参酮IIA(TSA)的化学结构式

      Figure 1.  Chemical structure of Tanshinone IIA (TSA)

    • SD大鼠(雄性,8周,200~220 g)购自上海西普尔必凯实验动物有限公司。将大鼠随机分为4组:BCCAO+溶剂组,BCCAO+TSA组(15 mg/kg),BCCAO+多奈哌齐组(1 mg/kg)和假手术组+溶剂组。药物预给药2周后,根据先前报道的实验方法进行BCCAO手术[19],术后连续4周对大鼠进行灌胃给药,随后进行水迷宫测试。

    • 通过MMW测试空间学习和记忆能力[20]。MWM系统(AniLab Software & Instruments)包括一个充满水的圆形水池,直径为150 cm,深度为50 cm,分为四个象限并带有视觉提示。第1天为适应训练,装置中放置一个可见的平台(直径10 cm)来测试大鼠的视觉和运动能力。在第2~5天,将平台下降到水面以下,每天进行两次定位航行训练。在测试阶段,平台被移走,将每只大鼠依次从与目标象限相反的方向放入装置,由视频分析系统记录大鼠在目标象限停留的时间和运动轨迹。

    • 大鼠麻醉后,依次经心脏灌注生理盐水和4%的多聚甲醛(PFA),将大脑储存在PFA中。将梯度脱水、石蜡包埋的大脑组织制作成石蜡切片(厚5 μm)。将切片脱蜡后滴加尼氏染色液染色10 min,酒精梯度脱水后浸入二甲苯中透明,最后用中性树脂封片。使用Image J软件对Nissl染色阳性细胞进行计数。

    • 将蛋白酶抑制剂和1 mM PMSF在使用前加入于RIPA裂解缓冲液,并在冰上裂解组织。将组织蛋白(上样量为30 μg)通过12%分离胶分离,并转膜到0.45 μm PVDF上。用5%脱脂牛奶封闭2 h后,将目标条带依次与抗BDNF抗体(1∶1 000)孵育过夜,室温下与二抗IgG孵育2 h。通过ECL发光液检测显色条带,使用化学发光成像仪(Tanon 5200s)曝光并用Image J软件对条带进行定量。

    • 石蜡切片脱蜡水化后置于柠檬酸缓冲液中,微波高火15 min进行抗原热修复,自然冷却至室温。采用3%的H2O2封闭内源性过氧化物酶,10%的山羊血清封闭非特异性结合,加入BDNF一抗(1∶200)于4 ℃孵育过夜。滴加生物素标记的羊抗兔IgG二抗于37 ℃孵育30 min,滴加HRP标记链霉亲和素37 ℃孵育30 min。滴加DAB显色,苏木精复染2 min后流水冲洗10 min返蓝。将切片经脱水、透明后封片,于显微镜(日本Nikon)下观察。

    • 如先前方法制备原代大鼠星形胶质细胞[21]。简而言之,通过断头使新生大鼠快速安乐死,并在冰上分离大脑皮层,去除脑膜后,将组织机械分散并通过75 μm细胞筛以制成单细胞悬液。200 g下离心5 min收集细胞,将细胞以2×106个 / mL的密度接种在25 cm2的培养瓶中,并在37 ℃和5%(体积分数)CO2培养箱中培养8~9 d,将混合的细胞在摇床(Labwit Scientific)中以200 r/min,37 ℃摇动24 h以除去附着在顶部的小胶质细胞和少突胶质细胞。通过免疫荧光鉴定获得的星形胶质细胞纯度。首先,将细胞接种在经过聚L-赖氨酸预处理的盖玻片上。待细胞贴壁后,用4% PFA在室温下固定15 min。将细胞用含5%BSA封闭1 h后与GFAP抗体(1∶1 000)在4 ℃孵育过夜。用PBS冲洗细胞3次,在室温下与荧光二抗IgG(1∶500)孵育2 h。将细胞与Hoechst33242(1 μg/ mL)孵育15 min。最后,将细胞漂洗3次,并在倒置荧光显微镜(日本Nikon)下观察。

    • 星形胶质细胞以1×105个 / mL接种于96孔板中培养24 h,TSA(0.001、0.01、0.1、1、2.5、5、10和20 μmol/L)处理细胞24 h后使用CCK-8检测细胞活力。在H2O2诱导的细胞损伤实验中,星形胶质细胞用TSA(0.001、0.01、0.1、1、2.5、5 μmol/L)预处理2 h后加入H2O2(100 μmol/L)24 h,每孔中加入10 μL CCK-8,并在37 ℃下继续培养4 h。通过Synergy 2多功能酶标仪(BioTek)450 nm波长的吸光度测量细胞活力。乳酸在LDH的作用下转化为丙酮酸,伴随着NAD+还原为NADH,NADH可以与INT反应形成甲臜,从而在490 nm波长处产生吸收峰。收集每组的上清液并在25 ℃下与工作溶液反应30 min。实验前将细胞与裂解液孵育60 min,以测量LDH的总释放量。各组LDH释放=([OD样品-OD空白] / [OD-OD空白])。

    • 通过JC-1测定试剂盒检测MMP。纯化的星形胶质细胞在加入H2O2之前用TSA预处理2 h,细胞与JC-1染料在37 ℃下孵育20 min。用JC-1缓冲液洗涤两次后,使用酶标仪(Perkin Elmer Enspire 2300)在525/590 nm和490/530 nm设置下检测聚合物与单体的荧光比值。

    • 使用ATP分析试剂盒分别检测星形胶质细胞、皮层和海马中的ATP水平。收集细胞或组织于冰上裂解,将样品在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min以获得上清液用于进一步测定。按照说明书要求,将检测溶液添加到96孔板中并在室温下孵育5 min。将10 μL上清液与100 μL检测溶液快速混合,并通过BioTek酶标仪测量化学发光。

    • ETC的复合物I(NADH脱氢酶)的活性通过复合物I酶活性检测试剂盒进行测量。在动力学测定中,将线粒体制备物添加到预先包被的微孔板中,微孔板中包含捕获复合物I的特异性抗体。复合物I活性是通过NADH氧化为NAD+的同时能还原提供的染料,从而导致在450 nm处的吸光度增加,按照细胞色素氧化酶活性测定试剂盒评估复合物IV活性。在室温下制备稀释的细胞色素c的工作液与待测样本混合。还原的细胞色素c经氧化导致550 nm处吸光度降低,进而测定酶的活性。

    • 根据先前描述的方法[22]使用DCFH-DA评估ROS。DCFH-DA可以自由通过细胞膜,并且容易水解为非荧光DCFH,后者可以被ROS进一步氧化生成荧光DCF。分别用终浓度分别为0、0.1、1、2.5、5 μmol/L的TSA处理纯化的星形胶质细胞2 h。细胞与DCFH-DA(10 μmol/L)和Hoechst33242(1 μg/ mL)在37 ℃下共孵育20 min后,PBS漂洗细胞三次,加入100 μmol/L H2O2作用30 min并通过荧光显微镜观察荧光强度。

    • 将星形胶质细胞在6孔板中培养24 h,然后用TSA(0.1、1、2.5和5 μmol/L)预处理细胞2 h,加入100 μmol/L H2O2 24 h,收集细胞在冰上裂解,然后按照说明书的要求测量GSH,SOD,MDA水平,将结果通过蛋白含量标准化。

    • 数据表示为(平均值±标准误差)。在水迷宫中,通过双因素方差分析大鼠的逃避潜伏期。其他数据使用单因素方差分析,使用SPSS Statistics 22.0.0.0进行组间的差异性比较。P<0.05被认为有显著性差异,*P<0.05,** P<0.01,***P<0.001,#P<0.05,## P<0.01,###P<0.001。

    • 用MWM评估TSA对BCCAO大鼠认知功能的影响。在定位航行训练中,BCCAO组的大鼠比假手术的大鼠花费更多的时间来寻找平台(训练第2天,P<0.01;第3天,P<0.05)。如图2(a)所示,TSA和多奈哌齐(作为阳性对照)处理的大鼠的逃避潜伏期短于BCCAO大鼠。如图2(b)所示,在测试阶段,BCCAO大鼠在目标象限的时间明显减少,TSA处理延长了大鼠在平台象限的停留时间。多奈哌齐也减轻了BCCAO引起的认知能力下降,但在测试剂量下未达到统计学差异。同时,图2(c)排除了游泳速度对实验结果的影响,各组大鼠代表性的游泳路径图如图2(d)所示。

      图  2  (a)在隐藏平台试验中的大鼠潜伏期;(b)在测试阶段大鼠在目标象限的停留时间;(c)平均运动速度;(d)测试阶段代表性的游泳轨迹图

      Figure 2.  (a) Latency of rats in hidden platform trials; (b) Time spent in the target quadrant in probe test; (c) Swimming speed during the water maze test; (d) Representative swimming track in probe test (n=17)

    • 海马是主要负责工作记忆和定向导航的部位[23]。通过尼氏染色的对大鼠海马进行形态学分析,分别对CA1,CA3和齿状回(DG)区域中存活神经元计数。如图3(b)图3(c)中,BCCAO大鼠与假手术组相比,CA1和CA3区域中的神经元明显减少,而通过TSA的治疗可以明显逆转神经元的丢失。如图3(d)中所示,在DG区尼氏染色阳性细胞没有显著差异。

      图  3  (a)代表性的海马尼氏染色的显微照片;(b)~(d)海马CA1,CA3,DG区(n=3)中的细胞计数

      Figure 3.  (a) Representative photomicrographs of the hippocampus; (b)~(d) quantitative cells in hippocampal CA1, CA3, DG regions (n=3)

    • 据报道,BDNF可促进中枢神经系统神经元的存活[24]。通过western blot检测各组皮层和海马中BDNF的表达水平,图4(a)图4(b)分别为其定量结果。与假手术组相比,BCCAO损伤降低了皮层和海马中的BDNF水平,这与认知缺陷的结果是一致的。与BCCAO组相比,TSA处理组皮层和海马中的BDNF水平显著升高(#p<0.05)。BDNF免疫组化结果显示,各组均可见棕黄色阳性细胞,但BCCAO阳性染色细胞数减少,TSA和多奈哌齐对该损伤具有保护作用。

      图  4  Western Blot检测皮层(a)和海马(b)中BDNF的定量变化;(c)和(d)分别为皮层和海马中BDNF表达的代表性条带;(e)免疫组化检测皮层和海马中BDNF的表达水平

      Figure 4.  Quantitative changes of BDNF in the cortex (a) and hippocampus (b); Representative images of BDNF expression in the cortex (c) and hippocampus (d);(e) BDNF expression in cortex and hippocampus CA1 were detected by immunohistochemistry

    • 星形胶质细胞的免疫荧光鉴定示于图5(a)。为了确定TSA的有效浓度,将原代星形胶质细胞用浓度为0.001至20 μmol/L的TSA处理24 h。图5(b)中的CCK-8分析表明5 μmol/L或更低浓度的TSA对细胞活力没有影响,而更高浓度的TSA(10 μmol/L和20 μmol/L)则降低了细胞活力(分别为(88.46%±2.675%),(83.87%±2.520%))。因此,我们进一步选择0.001~5 μmol/L TSA检测其在H2O2损伤中的保护作用。H2O2处理后,细胞活力显著降低至(62.49%±1.722%),而0.01~5 μmol/L TSA显著逆转了H2O2诱导的细胞损伤,如图5(c)~5(e)中所示,TSA处理组提高了细胞活力,减少了LDH释放,并且缓解了细胞形态损伤。

      图  5  (a)GFAP的免疫荧光染色;(b)通过CCK-8检测TSA作用时细胞活力;(c)通过CCK-8的测定H2O2损伤时细胞活力;(d)LDH释放检测;(e)在显微镜下观察细胞形态变化

      Figure 5.  (a) Immunofluorescent staining of the GFAP; (b) cell viability measured by CCK-8 assay after TSA treatment; (c) Cell viability and cytotoxicity were detected by the assays of CCK-8; (d) LDH release; (e) Cellular morphology changes were captured under biological microscope

    • 图6(a)中显示,在H2O2处理的星形胶质细胞中出现明显的MMP下降,而5 μmol/L TSA使MMP恢复到了正常对照水平。我们推断,TSA抑制H2O2引起的MMP丢失,可能进一步改善线粒体能量代谢的功能障碍。ATP在细胞的各种生理和病理过程中起重要作用。通常,ATP水平下降表明线粒体功能受损[25]图6(b)~6(d)中显示,H2O2处理的星形胶质细胞和BCCAO组均具有ATP下降。TSA预处理可以提高ATP水平。这些结果表明了TSA在由H2O2和BCCAO引起的能量代谢紊乱中发挥保护作用。

      图  6  (a)H2O2损伤模型中星形胶质细胞的MMP水平变化;皮层((b),n=4)、海马((c),n=3)星形胶质细胞(d)中的ATP水平;皮层((e),n=5)和海马((f),n=3)中的复合物I活性;皮层((g),n=4)和海马((h),n=4)中的复合物IV活性

      Figure 6.  (a) MMP levels in the astrocytes with H2O2 injury; ATP levels in the cortex ((b), n=4) and hippocampus ((c), n=3), respectively; (d) ATP levels in the astrocytes with H2O2 injury; Complex I activity in the cortex ((e), n=5) and hippocampus ((f), n=3); Complex IV activity in the cortex ((g), n=4) and hippocampus ((h), n=4).

      图6(e)图6(f)中分别显示了皮层和海马中复合物I活性。我们的结果表明,BCCAO大鼠的皮层和海马的复合物I活性均降低,TSA改善了皮层和海马的复合物I活性,但在多奈哌齐治疗的大鼠中未观察到显著变化。图6(g)图6(h)中分别显示了皮层和海马中复合物IV活性。复合物IV是ETC的末端电子受体,并参与ATP合成。在BCCAO组的皮层中观察到复合物IV活性显著增加,TSA处理逆转了这种变化。与BCCAO组相比,TSA和多奈哌齐均提高了海马的Complex I和Complex IV活性,但数据未显示出显著差异。

    • 图7(a)为通过荧光显微镜观察TSA对H2O2诱导的氧化应激中ROS产生的影响,半定量结果如图7(b)所示。与对照组(3.93±1.044)相比,H2O2处理的星形胶质细胞中DCF荧光显著增加(12.81±1.610,P<0.001),表明有明显的ROS产生。TSA(0.1~5 μmol/L)以剂量依赖性方式减弱了H2O2诱导的ROS生成。检测TSA对H2O2诱导的氧化应激中抗氧化的作用。如图7(c)所示,H2O2损伤明显提高了MDA水平,表明H2O2组具有显著升高的脂质过氧化水平。同时,图7(d)图7(e)显示,H2O2损伤降低了星形胶质细胞的SOD活性和GSH水平。TSA处理可将这些变化显著逆转,这些结果表明TSA对H2O2诱导的氧化应激中具有较强的抗氧化能力。

      图  7  (a)荧光显微镜拍摄ROS荧光照片;(b)ROS荧光的半定量;(c)MDA水平;(d)SOD活性;(e)GSH水平变化

      Figure 7.  (a) Photos of ROS fluorescence were captured by fluorescent microscope (scale bars: 200μm); (b) Semi-quantitation of ROS Fluorescence; (c) MDA level; (d) SOD activity; (e) GSH level were measured

    • 许多神经退行性疾病和神经元功能丧失与线粒体功能障碍有关[26]。在这项研究中,TSA治疗显著逆转了BCCAO引起的认知缺陷(图2)以及CA1和CA3区的神经元丢失(图3)。除了神经营养作用外,BDNF还具有神经保护作用,包括抗凋亡,抗氧化和抑制自噬[27]。BDNF可以保护大鼠原代皮层细胞的线粒体功能[28]。据报道多奈哌齐可通过提高BDNF的表达来改善大鼠BCCAO模型的认知功能[29]。与先前的研究[30]一致,我们的结果显示BCCAO大鼠有明显的空间学习和认知能力下降。TSA和多奈哌齐可增强脑组织中BDNF的水平(图4),表明BDNF的升高可能参与TSA的促智和神经保护作用。

      在我们的研究中,用100 μmol/L H2O2处理的原代星形胶质细胞明显导致细胞活力下降,LDH释放增加和异常形态变化(图5)。ROS异常升高可引起线粒体MMP降低,从而引起线粒体功能障碍,并加剧氧化还原状态的不平衡[31],从而加速细胞ATP耗竭,继而引起mPTP的开放和细胞凋亡[32]。我们发现,TSA处理可以显著维持MMP并改善ATP水平。TSA可以显著逆转H2O2和BCCAO引起的氧化损伤,可能是通过改善ROS引起的代谢功能障碍和维持线粒体功能参数而实现的。

      复合物I和III是呼吸链中ROS的主要来源[33]。复合物IV将电子转移到最终的电子受体,而复合物V或ATP合酶则利用膜电位作为驱动力来产生ATP[34]。与先前的研究一致[35],我们的研究发现BCCAO可以显著降低线粒体复合体I的活性。TSA可以提高脑组织(尤其是皮层)中复合物I的活性,表明它可以保护ETC复合物活性和ATP产生。有趣的是,我们发现BCCAO在皮层中具有明显增加的线粒体复合物IV活性,这与以前的研究[35]不一致。我们推测该结果可能是对电子泄漏增加的代偿作用,而TSA处理逆转了该变化。

      H2O2是ROS的主要形式,也是氧化应激的诱因。在H2O2处理的星形胶质细胞中观察到明显的细胞内ROS积累。用H2O2处理后,脂质过氧化的生物标志物MDA显著增加。在H2O2处理过的星形胶质细胞中观察到GSH水平和SOD活性显著降低(图6),这可能进一步导致自由基清除和氧化还原失衡,进而刺激ROS的形成[36]。TSA处理后ROS含量和MDA水平降低,同时,SOD活性增加,GSH水平上调(图7)。因此,TSA可以有效增强线粒体的生物能并改善氧化应激,该机制可能在TSA改善脑灌注不足和氧化损伤中发挥重要作用。

      总之,这项研究表明,TSA可能通过维持线粒体功能和减轻ROS引起的氧化应激,从而增强抗氧化防御,对BCCAO和H2O2引起的氧化损伤发挥有效的神经保护作用。我们的研究对TSA在脑缺血、脑灌注不足引起的认知障碍的保护作用提供了新的证据。

(7)  参考文献 (36) 相关文章 (8)

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