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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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(6,5)单壁碳纳米管对盐酸阿霉素的载药性能

    作者简介: 仲文博(1995-),女,河北人,硕士生,研究方向为药物分析;
    通讯作者: 张敏, zhangm@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: O63

Design of a Drug Delivering System Based on (6,5) Single-walled Carbon Nanotube Loaded with Doxorubicin Hydrochloride

    Corresponding author: Min ZHANG, zhangm@ecust.edu.cn ;
  • CLC number: O63

  • 摘要: 以分离后的单壁碳纳米管为载药工具,制备了一种(6,5)单壁碳纳米管-盐酸阿霉素-人血清白蛋白-叶酸((6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA)四元靶向载药系统。首先通过反应制备得到三元复合物Dox-HSA-FA,并采用双水相萃取法分离得到(6,5)SWCNT。采用超声作用将(6,5)SWCNT分散至Dox-HSA-FA中,制备得到(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA。最后,采用Hep G2细胞对四元复合物进行细胞毒性评价。结果表明,Dox-HSA-FA和(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA的IC50分别为27.3 μg/mL和25.7 μg/mL,表明四元复合物可以提高盐酸阿霉素的靶向性。
  • 图 1  Dox-HSA-FA的制备路线

    Figure 1.  Preparation route of Dox-HSA-FA

    图 2  Dox、HSA、FA、Dox-HSA-FA的(a)UV-Vis-Nir光谱图和(b)IR光谱图

    Figure 2.  (a)UV-Vis-Nir spectrum and(b)IR spectrum of Dox, HSA, FA and Dox-HSA-FA

    图 3  (a) SWCNTs分散液、(6,5)SWCNT的实物图和UV-Vis-Nir光谱图;(b) Dox-HSA-FA、(6,5)SWCNT、(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA的UV-Vis-Nir光谱图

    Figure 3.  (a) Photo and UV-Vis-Nir spectrum of SWCNTs dispersion and(6,5)SWCNT; (b) UV-Vis-Nir spectrum of Dox-HSA-FA、(6,5)SWCNT、(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA

    图 4  经Dox-HSA、Dox-HSA-FA、(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA作用24 h后Hep G2细胞的存活率

    Figure 4.  Cell viability of Hep G2 cells treated with Dox-HSA, Dox-HSA-FA,(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA for 24 h

    图 5  经SWCNTs-Dox-HSA-FA、(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA作用24、48、72 h后Hep G2细胞的存活率

    Figure 5.  Cell viability of Hep G2 cells treated with SWCNTs-Dox-HSA-FA and(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA for 24, 48 and 72 h

  • [1] AYMAN S, WESAM E, AHMED S, et al. A review on the efficacy and toxicity of different doxorubicin nanoparticles for targeted therapy in metastatic breast cancer[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2017, 95: 1209-1218.
    [2] XING Y X, DING T, WANG Z Q, et al. Temporally controlled photothermal/photodynamic and combined therapy for overcoming multidrug resistance of cancer by polydopamine nanoclustered micelles[J]. ACS applied materials & interfaces, 2019, 11(15): 13945-13953.
    [3] 李颖. 阿霉素/二甲双胍共载脂质体的构建及克服肿瘤多药耐药的研究[D]. 浙江大学, 2018.
    [4] NIGAM S, BARICK K C, BAHADUR D, et al. Development of citrate-stabilized Fe3O4 nanoparticles: Conjugation and release of doxorubicin for therapeutic applications[J]. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2010, 323(2): 237-243.
    [5] IIJIMA S. Helical microtubules of graphitic carbon[J]. Nature, 1991, 354: 56-58. doi: 10.1038/354056a0
    [6] IIJIMA S, ICHIHASHI T. Single-shell carbon nanotubes of 1 nm diameter[J]. Nature, 1993, 363(6430): 603-605. doi: 10.1038/363603a0
    [7] 李红波, 张静, 金赫华, 等. 单一导电属性及手性单壁碳纳米管的分离技术[J]. 物理化学学报, 2012, 28(10): 2447-2455. doi: 10.3866/PKU.WHXB201209041
    [8] ANTONELLI A, SERAFINI S, MENOTTA M, et al. Improved cellular uptake of functionalized single-walled carbon nanotubes[J]. Nanotechnology, 2010, 21(42): 425101. doi: 10.1088/0957-4484/21/42/425101
    [9] HASHEMZADEH H, RAISSI H. The functionalization of carbon nanotubes to enhance the efficacy of the anticancer drug paclitaxel: a molecular dynamics simulation study[J]. Journal of molecular modeling, 2017, 23(8): 222. doi: 10.1007/s00894-017-3391-z
    [10] LIU J J, WANG C, WANG X J, et al. Mesoporous silica coated single-walled carbon nanotube served as drug carrier used for cancer combination therapy[J]. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2016, 12(2): 522-523.
    [11] 李洁, 张敏, 章弘扬, 等. (6,5)手性单壁碳纳米管的双水相分离及其对紫杉醇的载药研究[J]. 华东理工大学学报(自然科学版), 2019, 45(1): 67-73.
    [12] LI R B, WU R A, ZHAO L, et al. P-Glycoprotein antibody functionalized carbon nanotube overcomes the multidrug resistance of human leukemia cells[J]. ACS Nano, 2010, 4(3): 1399-1408. doi: 10.1021/nn9011225
    [13] CHENG W, NIE J P, XU L, et al. pH-sensitive delivery vehicle based on folic acid-conjugated polydopamine-modified mesoporous silica nanoparticles for targeted cancer therapy[J]. ACS applied materials & interfaces, 2017, 9(22): 18462-18473.
    [14] 徐欢, 周美玲, 葛琳, 等. 人血清白蛋白在蛋白多肽类药物长效化中的应用[J]. 中国生物工程杂志, 2019, 39(1): 82-89.
    [15] ESTHER H, RONALD L, RUTH M. The covalent binding of daunomycin and adriamycin to antibodies, with retention of both drug and antibody activity[J]. Cancer Research, 1975, 35(5): 1175-1181.
    [16] BARBARA S, SILVIA A. Design of folic acid-conjugated nanoparticles for drug targeting[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2000, 89(11): 1452-1464. doi: 10.1002/1520-6017(200011)89:11<1452::AID-JPS8>3.0.CO;2-P
    [17] 瞿小兰. 叶酸-白蛋白-多柔比星的制备及其抗肿瘤性质研究[D]. 华中科技大学, 2009.
    [18] OHKAWA K, HATANO T, TSUKADA Y, et al. Chemotherapeutic efficacy of the protein-doxorubicin conjugates on multidrug resistant rat hepatoma cell line in vitro[J]. British journal of cancer, 1993, 67(2): 274-278. doi: 10.1038/bjc.1993.52
    [19] RIPAMONTI M, PEZZONI G, PESENTI E, et al. In vivo anti-tumour activity of FCE 23762, a methoxymorpholinyl derivative of doxorubicin active on doxorubicin-resistant tumour cells[J]. British journal of cancer, 1992, 65(5): 703-707. doi: 10.1038/bjc.1992.148
    [20] COLEY H M, TWENTYMAN P R, WORKMAN P, et al. 9-Alkyl, morpholinyl anthracyclines in the circumvention of multidrug resistance[J]. European journal of cancer, 1990, 26(6): 665-667. doi: 10.1016/0277-5379(90)90112-7
  • [1] 宁秦洁陈颖闫梦迪胡泽岚吴侠杜增民郑静肖啸 . 人体肝脏靶向性新型AAV血清型载体的研发. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190312002
    [2] 尚旭景希玮徐健郑柏存公维光 . 不同分子量聚乙烯吡咯烷酮对多壁碳纳米管分散性能的影响. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20180820002
    [3] 全丽娜刁妍妍李巧李文杰朱丽丽李洪林 . 靶向PD-1的多肽阻断剂的设计及评价. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20181126003
    [4] 赵剑沈阳曹旭妮 . 基于铁蛋白的溶栓蛋白纳米粒子的构建及活性分析. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20180601001
    [5] 崔秋花许振良潘鹤林李树庭叶宇威 . 纳滤膜脱除稀盐酸中Ca2+和Mg2+. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20181128001
    [6] 梁培培高淑红姚开亚孙玲玲张志勇赖珅 . 丙三醇对螺旋霉素I发酵的影响及机理分析. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20181228001
    [7] 邓燕刘慧张飞旭吴侠郑静张井岩 . 槲皮苷铜配合物作为P-糖蛋白抑制剂的研究. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190601001
    [8] 李冰丛自豪肖希勉武月铭刘润辉 . 氨基酸聚合物用于提高冻干过程中蛋白稳定性的研究. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190422001
    [9] 刘靖康李猛王铭纬徐益升 . 基于瞬时纳米沉淀法的球形纳米粒子电荷及粒径调控. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190227003
    [10] 于苗钱锋胡贵华隆建李天越 . 工业级MIP提升管反应器气固两相流动特性的数值模拟. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20180913003
    [11] 盛宙颜秉勇周家乐王慧锋 . 基于模糊C均值和SLIC的纳米孔阻断事件的识别与研究. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20181206002
    [12] 徐田刘艺军何颖程起林 . CoNi-MOF/RGO复合物纳米片的制备及其储锂性能. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190329001
    [13] 钟郭程陈涛赵黎明邱勇俊徐梦帆 . 立构二嵌段聚乳酸微纳米纤维的制备与结晶性能. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190404002
    [14] 周倩李莉张涛付智楠郭旭虹 . 基于磁性球形聚电解质刷制备可回收的银纳米催化剂. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20180705001
    [15] 李俊潮陈启斌谭慧玲孟晨晨刘洪来 . 基于Boc-D-丙氨酸的手性聚合物纳米颗粒的聚集诱导发光. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20180514001
    [16] 常成戴一铭段先健王跃林胡彦杰李春忠 . 高温火焰处理纳米二氧化硅及其对硅橡胶的补强性能. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190717005
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-11-22
  • 网络出版日期:  2020-04-08

(6,5)单壁碳纳米管对盐酸阿霉素的载药性能

    作者简介:仲文博(1995-),女,河北人,硕士生,研究方向为药物分析
    通讯作者: 张敏, zhangm@ecust.edu.cn
  • 1. 华东理工大学药学院,上海市新药设计重点实验室
  • 2. 化学与分子工程学院,上海市功能性材料化学重点实验室,上海 200237

摘要: 以分离后的单壁碳纳米管为载药工具,制备了一种(6,5)单壁碳纳米管-盐酸阿霉素-人血清白蛋白-叶酸((6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA)四元靶向载药系统。首先通过反应制备得到三元复合物Dox-HSA-FA,并采用双水相萃取法分离得到(6,5)SWCNT。采用超声作用将(6,5)SWCNT分散至Dox-HSA-FA中,制备得到(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA。最后,采用Hep G2细胞对四元复合物进行细胞毒性评价。结果表明,Dox-HSA-FA和(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA的IC50分别为27.3 μg/mL和25.7 μg/mL,表明四元复合物可以提高盐酸阿霉素的靶向性。

English Abstract

  • 盐酸阿霉素(Doxorubicin Hydrochloride,Dox)是一种常见的蒽环类抗肿瘤药物。该药物可以嵌入DNA中破坏拓扑异构酶II介导的DNA修复,实现抗肿瘤作用[1]。Dox具有广谱抗肿瘤的优点,对多种癌症有较好的治疗效果,但其毒副作用和肿瘤细胞对Dox的耐药性[2]对其临床应用造成一定程度的限制。为了解决上述问题,李颖[3]构建了阿霉素/二甲双胍共载脂质体,从而改变药物进入细胞的方式,降低了阿霉素的毒副作用。Saumya等[4]制备了柠檬酸盐稳定的Fe3O4纳米颗粒装载阿霉素,使阿霉素在肿瘤的弱酸性环境中可以大量释放,增大药物浓度以提高药效。

    碳纳米管是由单层或多层石墨六边形网格平面沿手性矢量卷绕而成的管状结构[5-6],分别命名为单壁碳纳米管(Single-walled Carbon Nanotubes,SWCNTs)和多壁碳纳米管。单层石墨片沿不同的卷曲方向可以获得手性结构不同的SWCNTs,不同手性(n,m)SWCNT具有不同的性质。当n-m=3qq为正整数)时,称为半金属型碳管;当n-m=0时,被称为金属型碳管,其导电率可高达铜的近千倍;当n-m=3q±1时,被称为半导体型管,具有优异的电子迁移率[7]。因SWCNTs具有独特的结构,使其可以穿透细胞膜[8]。而且因其比表面积较大,可以实现药物的有效负载[9]。将SWCNTs经各种物质修饰改性可以制备纳米载药体系,从而实现对药物的运输以及可控释放[10-11],减小肿瘤细胞对药物的耐药性[12]。但当前方法制备得到的SWCNTs含有多种手性以及无定形碳等杂质,对其应用造成了一定的限制,因而需要对其分离以获得单一手性的SWCNT。

    叶酸(Folic Acid,FA)受体在多种肿瘤细胞如乳腺癌、子宫内膜癌等中高表达[13]。可以将FA作为寻靶分子修饰药物载体材料,通过FA与FA受体特异性结合,增强给药体系的肿瘤主动靶向性,降低其在正常组织中的分布,减少不良反应的发生,从而获得更好的治疗效果。人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是人体血浆中含量最高的蛋白质,约占血浆总蛋白含量的50%,由肝脏合成。HSA具有丰富的可修饰基团,可与药物以化学键共价结合,起到存储与运输药物的作用[14]。同时,HSA具有安全无毒、无免疫源性和生物相容性高等优点。

    本文以分离后的SWCNT作为载药工具,制备了一种(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA四元靶向纳米载药系统。一方面,以HSA作为桥梁,将FA和Dox以共价键连接,通过FA提高给药的靶向性。另一方面,HSA增强了(6,5)SWCNT在水中的分散性,其生物相容性也降低了(6,5)SWCNT对细胞的毒性作用。同时因单一手性(6,5)SWCNT的存在更进一步提高了复合物对癌细胞的抑制作用。

    • 盐酸阿霉素(Dox):纯度98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;高碘酸钠(NaIO4):AR,上海麦克林生化科技有限公司;人血清白蛋白(HSA):纯度96%~99%(琼脂糖凝胶电泳),上海耐澄生物科技有限公司;氰基硼氢化钠(NaCNBH3):纯度95%,上海麦克林生化科技有限公司;叶酸(FA):纯度≥97%(HPLC),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl):纯度≥99%,上海笛柏生物科技有限公司;单壁碳纳米管(SWCNTs):管径范围0.7~0.9 nm,碳含量≥95%,SWCNTs含量≥93%,Sigma-Aldrich有限公司;聚乙二醇(PEG):Mw=6 000,Sigma-Aldrich公司;葡聚糖(Dex):Mw=70 000,京化成工业株式会社;十二烷基硫酸钠(SDS):CP,永华化学科技(江苏)有限公司;脱氧胆酸钠(SDC):纯度98%,Sigma-Aldrich公司;二乙烯三胺五甲叉膦酸(DTPMP):50%水溶液,阿达玛斯试剂有限公司;透析袋:截留分子量为12 000~14 000,美国Spectrumlabs公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒:P10012S,上海碧云天生物技术有限公司;实验用水均为超纯水。

    • SCQ-250F型功率可调细胞粉碎机(中国上海声彦超声波仪器有限公司);GT 16-WS型高速离心机(中国赛默飞世尔科技公司);UV-2600型紫外-可见-近红外吸收光谱仪(日本岛津公司);ST-360型酶标仪(中国上海科华生物工程股份有限公司);NICOLET 380型傅里叶转换红外光谱仪(中国赛默飞世尔科技公司)。

    • Dox-HSA-FA的制备路线如图1所示,称取10.0 mg Dox,加入1.0 mL超纯水溶解,再加入稍过量的0.1 mol/L NaIO4溶液,室温下避光反应1 h。加入适量的1.0 mol/L丙三醇溶液以中和过量的NaIO4,反应30 min。称取60.0 mg HSA,加入2.0 mL Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(0.1 mol/L,pH=9.0)溶解,加入上述反应液中,反应1 h。加入适量NaCNBH3,在37 ℃下避光反应2 h[15-16]。反应液经离心,透析后冻干,得到Dox-HSA的冻干产物。调整NaCNBH3的用量分别为10、20、30、40 mg,同时调整Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液的pH=9.0、9.5、10.0、11.0、12.0,重复上述实验进行优化。

      图  1  Dox-HSA-FA的制备路线

      Figure 1.  Preparation route of Dox-HSA-FA

      称取5.0 mg FA,加入5.0 mL DMSO溶解。再加入30.0 mg的EDC.HCl,室温下避光反应1 h以活化FA上的羧基。称取30.0 mg Dox-HSA的冻干产物,加入1.0 mL Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(0.1 mol/L,pH=9.8)溶解,加入上述反应液中,反应2 h[17]。反应液离心,透析后冻干,得到Dox-HSA-FA的冻干产物。

    • 配制1.0 mg/mL Dox储备液,并逐级稀释至质量浓度(ρDox)分别为0.2、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0 μg/mL,分别测定其在495 nm的吸光度(A495),绘制A495对于CDox的一元回归曲线。测定Dox-HSA溶液的A495,代入一元回归曲线方程,计算Dox-HSA中Dox的含量。

    • 采用BCA法测定Dox-HSA、Dox-HSA-FA中HSA的含量。配制1.0 mg/mL HSA标准母液,逐级稀释至浓度(ρHSA)分别为0.006、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL,每个浓度设置两个平行。将BCA试剂A和试剂B以体积比为50∶1混合,配成BCA工作液。分别取20 μL不同浓度的HSA标准溶液以及复合物溶液,再加入200 μL BCA工作液混合,室温下静置2 h。分别测定样品在559 nm的吸光度(A559),绘制A559对于CHSA的一元回归曲线。将复合物样品的A559代入一元回归曲线方程,计算复合物中HSA的含量。

    • 称取1.0 mg FA溶于1 mL Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液,配成1.0 mg/mL FA标准母液,逐级稀释至浓度(ρFA)分别为0.5、10、20、30、40、50 μg/mL的FA标准溶液,分别测定其在360 nm的吸光度(A360),绘制A360对于CFA的一元回归曲线。测定样品的A360,代入一元回归曲线方程,计算Dox-HSA-FA中FA的含量。

    • 称取1.0 mg SWCNTs加入SDC溶液(w为2%,1 mL),在225 W下超声1 h,同时冰水浴冷却,离心1 h,取上清液得到SWCNTs分散原液。移取PEG溶液(w为15%,250 μL)和Dex溶液(w为15%,250 μL)混合离心得到上相富含PEG,下相富含Dex的双水相系统。加入10 μL SWCNTs分散原液后混合,离心。加入SDS溶液(w为10%,18 μL)后混合,离心。加入适量DTPMP溶液混合离心,使上相呈现出灰绿色,下相呈现出紫色。弃去上相,加入250 μL预先静置平衡的双水相系统的上相,混合离心,上相呈现紫色。加入适量SDC溶液,混合并离心,下相中最终得到淡紫色(6,5)SWCNT溶液,测定样品的UV-Vis-Nir光谱。

    • 将15.0 mg Dox-HSA-FA加入900 μL超纯水和100 μL Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液中溶解。加入上述制备所得的(6,5)SWCNT固体,在225 W下超声1 h,同时冰水浴冷却,离心1 h,取上清液得到(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA溶液。

    • 将含有0.1 mg/mL Dox的(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA溶液用培养基逐级稀释,使CDox依次分别为50.0、25.0、12.5、6.3、3.1 μg/mL。将含有0.1 mg/mL Dox的Dox-HSA、Dox-HSA-FA溶液以相同的方法进行稀释。取96孔板进行铺板,每孔约有6 000个Hep G2细胞,周边孔用PBS溶液填充,在培养箱中于37 ℃、5%的CO2的条件下培养24 h。弃去旧培养基,加入上述含有不同浓度复合物的新培养基,每个复合物浓度设置5个复孔,培养24 h。弃去旧培养基,加入新培养基,并加入MTT溶液,培养4 h。弃去旧培养基,加入DMSO,振摇10 min后,用酶标仪在492 nm下测定其吸收值,考察Hep G2细胞的存活率。

    • 测定Dox、HSA、FA、Dox-HSA-FA的UV-Vis-Nir吸收光谱,如图2(a)所示。Dox在495、290 nm的吸收峰为其特征吸收峰,HSA在280 nm的吸收峰为其特征吸收峰,FA在360 nm、280 nm的吸收峰为其特征吸收峰。由于HSA和FA在495 nm处无吸收,并且经过透析后Dox-HSA-FA样品中已不含游离的Dox,故Dox-HSA-FA在495 nm的特征吸收峰来源于已偶联的Dox。虽然Dox在360 nm也有弱吸收,但其吸光度仅为495 nm下吸光度的14.3%,并且Dox-HSA-FA经过透析已经完全除去游离的FA,由此可以断定三元复合物在360 nm下吸收峰来源于已偶联的FA。根据UV-Vis-Nir吸收光谱能够初步证实Dox、HSA、FA三者实现偶联。

      图  2  Dox、HSA、FA、Dox-HSA-FA的(a)UV-Vis-Nir光谱图和(b)IR光谱图

      Figure 2.  (a)UV-Vis-Nir spectrum and(b)IR spectrum of Dox, HSA, FA and Dox-HSA-FA

      测定Dox、HSA、FA、Dox-HSA-FA的IR光谱,如图2(b)所。在3 327、1 583、1 284、995 cm−1的吸收峰为Dox的特征吸收峰。在3 306、1 656、1 538 cm−1的吸收峰为HSA的特征吸收峰。在3 327、3 116、1 694、1 606、1 484 cm−1的吸收峰为FA的特征吸收峰。Dox-HSA-FA在3 292、1 655、1 536 cm−1出现了强吸收峰。比较复合物与Dox、HSA、FA的IR光谱,可以得出上述强吸收峰主要来源于HSA。但是由于复合物中HSA的含量远远高于Dox和FA的含量,Dox和FA的特征吸收峰基本被覆盖。结合UV-Vis-Nir吸收光谱图,可以证明Dox、HSA、FA三者偶联成功。

    • HSA在495 nm处无吸收,故在495 nm下测定Dox-HSA中Dox的含量。Dox的A495CDox的一元线性回归曲线方程为:A495=23.1 CDox+0.015 1,R2=0.999 8。将Dox-HSA溶液的A495代入上述回归曲线方程,得到Dox-HSA溶液中ρDox=0.31 mg/mL。

      HSA与BCA试剂形成紫色的复合物,该复合物的最大吸收波长在559 nm处,故在559 nm下测定Dox-HSA中HSA的含量。A559CHSA的一元线性回归曲线方程为:A559=1.3547 ρHSA+0.012 7,R2=0.999 8。将Dox-HSA样品溶液的A559代入上述回归曲线方程,得到Dox-HSA溶液中ρHSA=12.09 mg/mL。

    • 采用式(1)[17]计算Dox对HSA的偶联比:

      其中,MDox/MHSA为Dox对HSA的偶联比,ρDox为Dox的质量浓度(mg/mL),Dox的分子量为597.99,ρHSA为HSA的质量浓度(mg/mL),HSA的分子量为66 000。

      ρDox=0.31 mg/mL,ρHSA=12.09 mg/mL代入公式,得出MDox/MHSA=2.8。文献报道当Dox对血清白蛋白的偶联比在2~5时,可以克服Dox对肿瘤细胞的耐药性[18-20],而且偶联比越高,说明每单位质量HSA负载的Dox越多。

    • 按照2.1节中所述方法测定不同条件下制备所得Dox-HSA中Dox对HSA的偶联比,考察NaCNBH3的用量和Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液的pH以优化实验。当NaCNBH3的用量分别为10、20、30、40 mg时,偶联比分别为3.3、2.9、2.4、2.4。说明10 mg为合适用量,过量使用NaCNBH3反而使偶联比下降。当Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液的pH=9.0、9.5、10.0、11.0、12.0时,偶联比分别为2.8、3.3、3.2、3.3、3.2表明pH>9.5时,偶联比均位于3~5之间,具有较高的偶联比,可以克服Dox对肿瘤细胞的耐药性[18-20]

    • FA的特征吸收峰位于360 nm,故作为测定Dox-HSA-FA中FA含量的特征吸收波长。FA的A360ρFA的一元线性回归曲线方程为:A360=16.2 ρFA+0.011 6,R2=0.999 8。将Dox-HSA-FA的A360代入上述回归曲线方程,得到Dox-HSA-FA溶液中ρFA=0.48 mg/mL。将Dox-HSA-FA样品溶液的A559代入HSA的一元线性回归曲线方程,得到Dox-HSA-FA样品溶液中ρHSA=20.91 mg/mL。

    • 采用式(2)[17]计算FA对HSA偶联比:

      其中,MFA /MHSA为FA对HSA的偶联比,ρFA为FA的质量浓度(mg/mL),FA的分子量为441.40;ρHSA为HSA的质量浓度(mg/mL),HSA的分子量为66 000。

      ρFA=0.48 mg/mL,ρHSA=20.91 mg/mL代入上述公式,得出MFA /MHSA=3.4。

    • 本文选用的SWCNTs中含有多种手性体,如(7,6)、(7,5)、(8,3)、(6,5)、(9,1)、(7,3)、(6,4)SWCNT。未分离的SWCNTs分散液中由于多种手性SWCNTs的存在而呈现出黑色,而分离后的(6,5)SWCNT溶液呈现出紫色。如图3(a)所示,分离后的(6,5)SWCNT溶液在571 nm和985 nm出现了较强的吸收峰,且峰形尖锐,是(6,5)SWCNT的特征吸收峰。而且与未分离的SWCNTs溶液相比,在1 120、1 024、912、952、873 nm和505 nm处并未出现明显的吸收峰,而这些吸收峰分别为(7,6)、(7,5)、(9,1)、(8,3)、(6,4)、(7,3)SWCNT的特征吸收峰。因此,可以确定分离所得的为单一手性(6,5)SWCNT。

      图  3  (a) SWCNTs分散液、(6,5)SWCNT的实物图和UV-Vis-Nir光谱图;(b) Dox-HSA-FA、(6,5)SWCNT、(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA的UV-Vis-Nir光谱图

      Figure 3.  (a) Photo and UV-Vis-Nir spectrum of SWCNTs dispersion and(6,5)SWCNT; (b) UV-Vis-Nir spectrum of Dox-HSA-FA、(6,5)SWCNT、(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA

      图3(b)可知,360 nm处吸收峰为FA和(6,5)SWCNT共同叠加得到的吸收峰。495 nm处吸收峰为Dox和(6,5)SWCNT共同叠加得到的吸收峰。571 nm和985 nm处吸收峰为(6,5)SWCNT的特征吸收峰,可以证明复合物中(6,5)SWCNT的存在,进一步证明成功制备得到(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA。

    • 由于985 nm处的吸收峰为(6,5)SWCNT的特征吸收峰,而且Dox、FA、HSA均在此波长处无吸收,故位于985 nm处的吸光度(A985)可以作为测定(6,5)SWCNT含量的依据。配制SWCNTs的质量浓度(ρSWCNTs)分别为0.1、1、2、4、8、10 μg/mL的SWCNTs分散液。由于SWCNTs中(6,5)SWCNT的初始含量为41%,故(6,5)SWCNT的浓度(ρ(6,5)SWCNT)分别为0.041、0.41、0.82、1.64、3.28、4.1 μg/mL。测定其A985并绘制A985C(6,5) SWCNT(μg/mL)的一元线性回归曲线方程:A985=0.224 4 ρ(6,5)SWCNT+0.023 6,R2=0.999 1。测定(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA的A985,代入上述回归曲线方程,得到ρ(6,5)SWCNT=48.4 μg/mL。

    • (6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA对Hep G2细胞的抑制作用的结果如图4所示。经三种复合物作用后,随着Dox浓度的增加,Hep G2细胞整体的存活率逐渐减小。但各复合物的作用效果之间存在一定的差异,当ρDox由3.1 μg/mL增加至50.0 μg/mL,经Dox-HSA作用后的细胞存活率由95.7%减少至70.1%,仅减少了25.6%;而经Dox-HSA-FA作用后的细胞存活率由87.3%减少至13.7%,减少了73.6%;经(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA作用后的细胞存活率由84.9%减少至11.1%,减少了73.8%。由此得出,随复合物浓度的增加,细胞存活率的下降幅度:(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA>Dox-HSA-FA>Dox-HSA。由GraphPad Prism软件计算Dox-HSA-FA和(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA的IC50分别为27.3 μg/mL和25.7 μg/mL。Dox-HSA-FA、(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA的IC50与Dox-HSA相比,差异均为极显著性(p<0.01)。

      图  4  经Dox-HSA、Dox-HSA-FA、(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA作用24 h后Hep G2细胞的存活率

      Figure 4.  Cell viability of Hep G2 cells treated with Dox-HSA, Dox-HSA-FA,(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA for 24 h

      ρDox相同的条件下,经Dox-HSA-FA作用后的细胞存活率均小于经Dox-HSA作用后的细胞存活率,经(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA作用后的细胞存活率又略微小于Dox-HSA-FA作用后的细胞存活率。综合比较得出,Dox-HSA对细胞的毒性作用一般,而Dox-HSA-FA和(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA对细胞的毒性作用明显,并且后者的毒性作用更强。由此可见复合物中FA起到了很好的靶向作用,增强了复合物对细胞的毒性作用,并且分离后的(6,5)SWCNT在一定程度上可以协助Dox在Hep G2细胞内的输送,又一定程度上增强了复合物对细胞的毒性作用。

      选取ρDox分别为12.5 μg/mL、6.3 μg/mL的SWCNTs-Dox-HSA-FA和(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA 4个复合物,分别将其与Hep G2细胞共培养24、48、72 h,测定Hep G2细胞的存活率。结果如图5所示,在两个浓度下,经(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA作用后的细胞存活率均低于经SWCNTs-Dox-HSA-FA作用后的细胞存活率。原因可能为经分离后所得的(6,5)SWCNT去除了SWCNTs样品中的无定形碳等杂质,更有利于Hep G2细胞对药物的内吞与扩散。因此,分离纯化后的(6,5)SWCNT比未分离的SWCNTs有更好的药物运输作用。

      图  5  经SWCNTs-Dox-HSA-FA、(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA作用24、48、72 h后Hep G2细胞的存活率

      Figure 5.  Cell viability of Hep G2 cells treated with SWCNTs-Dox-HSA-FA and(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA for 24, 48 and 72 h

      与此同时,随着复合物与Hep G2细胞共培养时间逐渐增加,Hep G2细胞的存活率逐渐降低。当ρDox=6.3 μg/mL时,Hep G2细胞经SWCNTs-Dox-HSA-FA作用后,细胞存活率由75.0%下降到52.6%再到40.4%,下降了22.4%又下降了12.2%;经(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA作用后,细胞存活率由70.8%下降到43.2%再到31.3%,下降了27.6%又下降了11.9%。当ρDox=12.5 μg/mL时,Hep G2细胞经SWCNTs-Dox-HSA-FA作用后的细胞存活率由51.7%下降到47.5%再到32.1%,下降了4.2%又下降了15.4%;经(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA作用后,细胞存活率由44.0%下降到32.7%再到23.7%,下降了11.3%又下降了9.0%。可以证明,此两种复合物对Hep G2细胞的抑制作用均随时间的增加而相应增强。培养48 h、72 h以后,(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA作用下的细胞存活率与SWCNTs-Dox-HSA-FA相比,差异均为极显著性(p<0.01)。经分析发现,四个条件下细胞的存活率随时间的增加而造成的下降趋势存在细微差异。当ρDox=6.3 μg/mL时,两种复合物在培养时间由24 h增加到48 h 细胞的存活率下降幅度非常明显,在48 h增加到72 h后呈现平缓下降趋势。分析原因可能是由于当ρDox=6.3 μg/mL,此浓度相对较低,培养24 h后无法对Hep G2细胞起到明显的抑制作用,适当延长培养时间到48 h,可以增强抑制作用。值得注意的是,给药48~72 h后,低浓度(6,5)SWCNT复合物的抑制作用与高浓度未分离SWCNTs复合物的抑制作用接近。

    • 本文建立了一种(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA复合物的制备方法。首先,以HSA作为桥梁,通过反应将Dox和FA共价偶联,制备了Dox-HSA-FA。其次,运用双水相萃取法分离得到单一手性且纯度较高的(6,5)SWCNT。最后,利用Dox-HSA-FA对(6,5)SWCNT进行分散,制备了(6,5)SWCNT-Dox-HSA-FA。本方法有效地将Dox、HSA、FA、(6,5)SWCNT四者复合。利用复合物中FA的靶向性,以(6,5)SWCNT作为药物载体,实现Dox靶向运送到Hep G2细胞,不仅提高肿瘤细胞对Dox的摄取,使其抗肿瘤活性得到增强。相较于未经分离的包含多种手性体的SWCNTs混合物,(6,5)SWCNT去除了SWCNTs样品中其它手性体及无定形碳等杂质,更有利于Hep G2细胞对药物的内吞及在胞内扩散。

(5)  参考文献 (20) 相关文章 (16)

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