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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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头孢氨苄降解菌的分离鉴定及其降解特性

    作者简介: 杨 涛(1995-),男,安徽,硕士生,主要研究方向:废水处理技术。E-mail:407025166@qq.com;
    通讯作者: 孙贤波, xbsun@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: X703.1

Isolation, Identification and Degradation Characteristics of Cephalexin Degrading Bacteria

    Corresponding author: Xianbo SUN, xbsun@ecust.edu.cn ;
  • CLC number: X703.1

  • 摘要: 从生活污水处理厂污泥中筛选出一株能高效降解头孢氨苄的菌株CQ2,鉴定为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)。考察了温度、pH、混合强度和接种量等对CQ2菌的生长和头孢氨苄降解效率的影响,确定最佳培养条件温度为30 ℃,pH为7.0,转速为150 rpm,接种量为5%。该条件下培养28 h,对水中初始浓度为10 mg/L的头孢氨苄降解率可达100%;对其他抗生素的降解效果:培氟沙星<磺胺嘧啶<土霉素<阿莫西林。基于LC-MS/MS测定的降解中间产物,提出了CQ2菌生物降解头孢氨苄的初步路径。
  • 图 1  菌株CQ2形态观察(a)菌落形态;(b)菌体形态

    Figure 1.  Morphology of strain CQ2: (A) colony; (B) cell shape

    图 2  基于16S rDNA序列同源性构建的菌株CQ2和亲缘性相近的其他细菌的系统发育树

    Figure 2.  Phylogenetic position of CQ2 based on 16s rDNA sequences analyses

    图 3  CQ2菌微生物生长曲线及CX降解曲线

    Figure 3.  Growth curve and degradation curve of CQ2 bacteria

    图 4  温度对微生物生长及CX降解效果的影响

    Figure 4.  Effects of temperature on microbial growth and CX degradation

    图 5  pH对微生物生长及CX降解效果的影响

    Figure 5.  Effects of pH on microbial growth and CX degradation

    图 6  转速对微生物生长及CX降解效果的影响

    Figure 6.  Effect of rotation speed on microbial growth and CX degradation

    图 7  接种量对微生物生长及CX降解效果的影响

    Figure 7.  Effects of inoculation amount on microbial growth and CX degradation

    图 8  CQ2菌生物降解CX的初步途径

    Figure 8.  Preliminary biodegradation of CX by CQ2 bacteria

    表 1  菌落生长及CX降解状况

    Table 1.  Colony growth and CX degradation

    StrainConcentration of CX/(mg·L−1
    1510
    Growth conditionsRemoval rate of CXGrowth conditionsRemoval rate of CXGrowth conditionsRemoval rate of CX
    CQ1+++++++
    CQ2++++++++++++
    CQ3++++++++
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    表 2  三株高效菌的形态学观察和鉴定结果

    Table 2.  Morphological observation and identification results of three highly effective strains

    StrainDescriptionGram stainIdentification result
    CQ1Round colonies, irregular edges, moist, dull, translucentNegativeSphingomonas sp.
    CQ2Round colonies, neat edges, moist, dull, pale yellowNegativeOchrobactrum sp.
    CQ3Round colonies, neat edges, glossy, orangeNegativeOchrobactrum sp.
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    表 3  CX理化性质

    Table 3.  Physicochemical properties of cephalexin

    Parameters ValueCX distribution at different pH values
    NameCX(Cephalexin)
    Chemical formulaC16H17N3O4S
    Molecular weight347.39
    CAS number15686-71-2
    pH(5 g·L−13.5~5.5
    IC50/μg·mL−156.38
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    表 4  CQ2菌对其他类抗生素去除率

    Table 4.  The removal rate of CQ2 bacteria to other antibiotics

    Antibiotic speciesAmoxicillinTerramycinSulfadiazinePefloxacin
    OD6001.2980.9860.4120.027
    Antibiotic removal rate/%100.0062.3450.295.12
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-10-09
  • 网络出版日期:  2020-06-06

头孢氨苄降解菌的分离鉴定及其降解特性

    作者简介:杨 涛(1995-),男,安徽,硕士生,主要研究方向:废水处理技术。E-mail:407025166@qq.com
    通讯作者: 孙贤波, xbsun@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学高浓度难降解有机废水处理技术国家工程实验室,上海 200237

摘要: 从生活污水处理厂污泥中筛选出一株能高效降解头孢氨苄的菌株CQ2,鉴定为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)。考察了温度、pH、混合强度和接种量等对CQ2菌的生长和头孢氨苄降解效率的影响,确定最佳培养条件温度为30 ℃,pH为7.0,转速为150 rpm,接种量为5%。该条件下培养28 h,对水中初始浓度为10 mg/L的头孢氨苄降解率可达100%;对其他抗生素的降解效果:培氟沙星<磺胺嘧啶<土霉素<阿莫西林。基于LC-MS/MS测定的降解中间产物,提出了CQ2菌生物降解头孢氨苄的初步路径。

English Abstract

  • 大量研究显示环境中低浓度的抗生素即可能诱导微生物抗药基因的产生[1]。中国是世界最大的抗生素生产和消费国,大量抗生素的使用及不当排放已对水环境健康构成重大潜在危胁。目前,国内各大地表水域乃至自来水中检测出不同浓度的抗生素[23]。头孢类抗生素具有抗菌谱广、低致敏、副作用小、品种繁多、杀菌能力强等优点,被频繁地用作临床抗感染类药物。头孢氨苄(Cephalexin, CX)是一种典型的头孢类抗生素,可抑制细菌细胞壁的合成,使得细胞原生质膨胀破裂而达到杀菌目的。研究表明,废水中微量抗生素进入环境中形成“假持久性”污染物,可导致生物毒性和诱导耐药性生物[4],该类问题已引起国内外学者的广泛关注。环境中的抗生素主要来自医院的医用废水、制药厂的工业废水和养殖场的畜禽废水等,这些废水通常以生物处理为主、物化法相结合的传统废水处理工艺,该类方法可有效去除常规污染物但难以完全去除废水中各类抗生素[5]。抗生素CX的母核“四元环并六元环”稠合体系受到的环张力较小,且含氮六元环中碳碳双键可与相连氮未共用电子对共轭,所以CX的性质很稳定,在自然环境中可以长期稳定存在。本研究旨在筛选出能高效降解CX抗生素的菌株,为传统生物法去除CX提供借鉴。

    高效菌法是得到针对某一种或一类难生物降解污染物的菌群,提高特定污染物去除率的方法,目前使用高效菌法对抗生素废水处理的研究越来越多,并在工程应用方面取得了一定突破。Lin B等从活性污泥中分离出两株假单胞菌CE21和CE22,在CX浓度为1 mg/L下培养24h可以对CX去除率分别达到90%和46.7%[6]。孙瑞珠等从长期堆放泰乐菌素药渣附近的土壤中分离出一株泰乐菌素优势降解菌,对泰乐菌素降解率可达99%,且应用于生物修复泰乐菌素废渣废水污染的环境具有较好的效果[7]。Wang等利用硝化菌在铵离子存在条件下通过共降解作用来降解50 μg/L的CX,去除率可达99%以上,但无铵离子情况下去除率小于44%[8]。目前,对难生物降解的头孢类抗生素的高效生物降解研究比较少,尤其在高效降解菌的分离以及降解机理方面的研究较少。

    为保证所得CX降解菌在污水环境中的耐受性,本文从某生活污水厂污泥中筛选纯化出了降解CX的高效菌,并对其进行了菌种鉴定,研究了温度、pH、转速、菌种投加量对微生物生长及降解效果的影响。同时,通过LC-MS/MS测定了高效菌降解CX的中间产物,推测了CX可能的生物降解路径。该工作对于水环境中头孢类抗生素的高效去除方法的开发具有重要理论和现实意义。

    • 实验材料:CX(98wt%),阿莫西林(98wt%),土霉素(98wt%),磺胺嘧啶(98wt%),培氟沙星(98wt%),甲醇为色谱级,蛋白胨、牛肉膏、琼脂、葡萄糖均为分析纯,都购自上海麦克林生化科技有限公司,NaCl、KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2SO4、NaNO3、MgCl2、ZnSO4、H3BO3、Na2MoO4、FeSO4、CaCl2、MnSO4纯度均不低于99.5wt%,都购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,针式滤器(尼龙,0.22 μm),实验用水均为超纯水。

      实验仪器:高效液相色谱仪(岛津LC-20AT),磁力搅拌器84-1A(上海司乐仪器有限公司),Sartarius BT224s分析天平、恒温振荡培养箱BSD-250(上海博讯实业有限公司)、洁净工作台(上海博讯实业有限公司)、PB-10型 pH计(上海精密科学仪器有限公司)、H-1型旋涡混合器(上海沪西仪器厂)、JYD-650L超声波细胞粉碎机(上海之信仪器有限公司)、DR5000分光光度计(美国Hach)、TGL-16G飞鸽离心机(上海安亭科学仪器厂)。

    • 牛肉膏蛋白胨培养基(LB):氯化钠10 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉膏5 g/L,调节pH至7.0—7.2。

      固态培养基:在LB培养基中加入琼脂20 g/L,高温灭菌溶解后冷却凝固。

      无机盐培养基:KH2PO4 1.5 g/L,K2HPO4 2.3 g/L,(NH4)2SO4 1 g/L,NaNO3 0.5 g/L。并加入微量元素:MgCl2 8 mg/L,ZnSO4 2 mg/L,H3BO3 0.4 mg/L,Na2MoO4 1 mg/L,FeSO4 2 mg/L,CaCl2 2 mg/L,MnSO4 2 mg/L,调节pH至7.0—7.2。使用前灭菌后冷却至室温,加入葡萄糖至5 g/L作为有机碳源。

      筛选培养基:在上述培养基经115 ℃高压灭菌20 min,冷却后加CX至浓度为10 mg/L。

    • 从某生活污水处理厂污泥中取新鲜污泥(MLVSS=3.852 g/L)1 mL,于超净台中转接至150 mL LB培养基中,在30 ℃、150 rpm恒温振荡培养箱中振荡2 d,设置不同浓度梯度(2,4,6,8,10 mg/L)的含CX抗生素的LB培养基,每隔2 d依次转接培养,直至培养基抗生素浓度为10 mg/L,得最终菌液培养液。

      涂布分离:取10 mL灭菌离心管装入0.5 mL最终培养液和4.5 mL无菌水,旋涡混合器混合1 min,得稀释10-1梯度,并依次稀释10-1到10-8,分别从8个离心管用移液枪取100 μL稀释液于固态培养基上,均匀涂布,后置于恒温培养箱30 ℃、150 rpm培养2 d。

      划线纯化:从涂布生长的平板上挑选出不同菌落特征的菌团,划线分离2-3次得到纯菌落并编号。

      高效菌筛选:将所得菌种在无机盐培养基中扩大培养24 h,取1 mL培养液转接到筛选培养基中,每隔一段时间取样测定其OD600和抗生素浓度,并分别作微生物的生长曲线和抗生素的降解曲线。

    • 选出最佳降解菌株,以培养温度、pH、接种量、混合强度为研究对象,将之前纯化培养24 h后的降解菌株转接到150 mL筛选培养基中,在不同条件下培养两天,定时取样测定微生物浓度和CX降解率,具体参数如下:

      1) 温度:调节培养基pH为7.0,接种量为1%(体积分数),转速150 rpm,培养时间2 d。设置温度梯度为20、25、30、35、40 ℃。

      2) pH:调节培养箱温度为30 ℃,接种量为1%(体积分数),转速150 rpm,培养时间2 d。设置培养基pH为3、4、5、6、7、8、9、10。

      3) 混合强度:调节培养基pH为7.0,接种量为1%(体积分数),培养箱温度为30 ℃,培养时间2 d。设置培养箱转速为90、120、150、180 rpm。

      4) 接种量:调节培养箱温度为30 ℃,转速150 rpm,培养基pH为7,培养时间2 d。设置接种量分别为1%,2%,3%,5%,10%(体积分数)。

      每组实验做三组平行。

    • 16S rDNA鉴定:采用天根细菌基因组提取试剂盒(DP302-02)提取细菌DNA。以基因组DNA为模板,PCR引物:27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG;1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT。扩增体系为20 μL,其中Taq酶10 μL,上下游引物各1 μL,模板1 μL,加入无菌水补充到20 μL,稍加混合后立即进行PCR扩增。PCR程序:94 ℃预变性3 min;进入循环:94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸100 s,共35个循环;最后72 ℃保温10 min。取10 μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,割取目的条带,按照天根回收试剂盒(DP214-03)纯化回收。采用sanger法进行测序。测序用的试剂盒为:BigDye v3.1 Chemistry kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)。之后使用3730XL DNA序列分析仪进行测序,并用DNA Sequencing analysis软件分析测序结果,Sequencing Analysis 5.2.0软件进行解读。

      菌种经过16S rDNA基因测序,所得碱基序列上传NCBI后,通过BLAST同GenBank中核酸数据比对分析,得到多个该菌种基因序列相近的种、属DNA碱基序列,使用CLUSTALX1.81软件对该菌种和其相近参比菌株的DNA碱基序列比较,并运用Mega软件临近法构建菌株试样与其相近参比菌株的系统发育树。

    • 样品经0.22 μm尼龙滤膜过滤后采用高效液相色谱(HPLC,岛津LC-20AT)测定CX浓度。HPLC条件:流动相为超纯水:甲醇=75:25 (v/v);流量:1 mL/min;柱温:40 ℃;进样量:10 μL;检测波长:260 nm;色谱柱为(Inertsil ODS-Sp, 5 μm, 4.6×250 mm),在该条件下CX检出范围为0.1-100 mg/L。

      采用LC-MS/MS分析中间产物。质谱条件:流动相为超纯水:甲醇=75:25(v/v);流量:1 mL/min;柱温:40 ℃;进样量:2 μL;扫描正离子模式,扫描范围m/z=50-350;雾化气流量:3 L/min;加热气流量:10 L/min;接口温度:300 ℃;干燥气流量:10 L/min;色谱柱(Shin-pack Giss C18 19 μm)。

      OD600值由分光光度计在600 nm波长下测定菌液吸光度所得。

    • 从生活污水中通过梯度浓度的抗生素驯化,涂布划线得到三株菌落一次命名为CQ1、CQ2和CQ3。各菌株在以CX为唯一碳源的无机盐培养基中不会生长,有研究表明,加入外碳源作为共代谢基质后,微生物利用后不仅可以合成细胞物质大量增殖,还能保持β-内酰胺类抗生素降解酶的活性,大大提高抗生素的去除效率[9],故实验中添加葡萄糖作为外加碳源。三种菌株在含葡萄糖的无机盐培养基中生长状况见下表1。其中CQ2菌株生长状况最好,且对CX具有最高的降解率,因此,选取CQ2菌株进一步研究其降解特性。

      StrainConcentration of CX/(mg·L−1
      1510
      Growth conditionsRemoval rate of CXGrowth conditionsRemoval rate of CXGrowth conditionsRemoval rate of CX
      CQ1+++++++
      CQ2++++++++++++
      CQ3++++++++

      表 1  菌落生长及CX降解状况

      Table 1.  Colony growth and CX degradation

    • 依照《真菌鉴定手册》、《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)对1.3筛选的3株高效菌株进行菌种形态鉴定如图1所示。菌落直径大小为4~6 mm,在1000倍光学显微镜下,CQ2菌呈杆状,菌体大小范围0.4~0.6×1.2~2.5 μm。经16S rDNA鉴定,CQ1为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.),CQ2和CQ3均为苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)如表2所示,菌株CQ2和亲缘性相近的其他细菌的系统发育树如图2所示。有研究表明,鞘氨醇单胞菌和苍白杆菌对β-内酰胺类抗生素具有耐药性,其中苍白杆菌对青霉素类、酶抑制复合剂和头孢菌素类等β-内酰胺类抗生素具有显著抗性[10-12]。苍白杆菌是具有平行边和圆端的杆菌,靠周身鞭毛运动,专性好氧异养型,能利用各种有机酸、氨基酸和碳水化合物作为有机碳源,目前为止,利用苍白杆菌降解头孢菌素类抗生素的研究仍非常少。

      图  1  菌株CQ2形态观察(a)菌落形态;(b)菌体形态

      Figure 1.  Morphology of strain CQ2: (A) colony; (B) cell shape

      StrainDescriptionGram stainIdentification result
      CQ1Round colonies, irregular edges, moist, dull, translucentNegativeSphingomonas sp.
      CQ2Round colonies, neat edges, moist, dull, pale yellowNegativeOchrobactrum sp.
      CQ3Round colonies, neat edges, glossy, orangeNegativeOchrobactrum sp.

      表 2  三株高效菌的形态学观察和鉴定结果

      Table 2.  Morphological observation and identification results of three highly effective strains

      图  2  基于16S rDNA序列同源性构建的菌株CQ2和亲缘性相近的其他细菌的系统发育树

      Figure 2.  Phylogenetic position of CQ2 based on 16s rDNA sequences analyses

    • 在含葡萄糖的无机盐培养基中,CX初始浓度10 mg/L,温度30 ℃,pH为7.0,转速150 rpm,接种量为1%(体积分数),采用分光光度法在波长600 nm下测定CQ2降解菌的吸光度并绘制生长曲线如图3所示。实验结果显示0-48 h为指数生长期,此期间微生物数量呈几何数增殖,生物代谢能力最强,研究细菌CQ2性状取对数期最佳。48—60 h为稳定期,微生物的生长导致营养物大量消耗以及有害代谢产物积累,从而导致微生物个数整体趋于饱和。

      图  3  CQ2菌微生物生长曲线及CX降解曲线

      Figure 3.  Growth curve and degradation curve of CQ2 bacteria

      利用微生物世代时间计算公式:

      式中,G为世代时间;t为培养时间;Mt为结束时活菌数;M0为初始活菌数。在对数生长期中取一段时间计算得到CQ2菌的世代时间为367 min。

      目前,Monod方程和Logistic方程被广泛应用于生物群体在约束条件下数量与时间的数学模型[13]。运用Logistic方程4参数拟合算法对CQ2菌株的生长曲线进行拟合,以此描述该菌的生长状况。

      Logistic方程:

      式中:X为微生物生长时间;Y为某时刻的微生物浓度(OD600值);A1为OD600的最小估计值;A2为OD600的最大估计值;X0为OD600值为OD600max/2时的时间,即微生物生长速度最快的时刻;P与X0处的曲线斜率有关。如图4所示,生长曲线经Logistic方程拟合相关系数可达0.9999,拟合曲线的表达式为y=1.422+1.4075/(1+(X/23.6399)4.2825)。因此,易知X0=23.6999,故取培养24 h的CQ2菌进行实验效果较好。

      图  4  温度对微生物生长及CX降解效果的影响

      Figure 4.  Effects of temperature on microbial growth and CX degradation

      从降解曲线看,CX在生长对数期CX被快速降解,36 h微生物对CX去除率即可达100%。Al-Gheethi A A S等从污水处理厂中筛选出67株能耐受10 mg/LCX的微生物,但混菌对5 mg/L CX的去除率仅为46.66%,且以生物吸附为主[14]。尽管Lin B等从活性污泥中分离出两株假单胞菌CE21和CE22在24 h可以对CX去除率分别达到90%和46.7%,但CX浓度仅为1 mg/L。因此,CQ2对CX具有较好的降解效果。

    • 温度对微生物的生长以及部分污染物降解相关酶的活性具有显著作用[15]。本实验将CQ2菌株接种到含葡萄糖的无机盐培养基中,在不同温度培养箱下避光培养36h。由图5可知,CQ2随温度的升高对CX降解率先升高后降低,30 ℃时达到最大去除率100%。随着温度的升高微生物浓度也呈现先升高后下降的趋势,30 ℃时OD600最大值为1.281(CFU为3.06×108个/mL),20 ℃和40 ℃时分别为0.758和1.233,这可能是由于温度影响了微生物胞内酶的活性和膜的通透性,高温或低温都会影响微生物的生长繁殖进而影响对CX的降解率[16]。所以,适宜CQ2菌最佳温度为30 ℃。

      图  5  pH对微生物生长及CX降解效果的影响

      Figure 5.  Effects of pH on microbial growth and CX degradation

    • 调节不同的pH,在恒温振荡培养箱内避光培养CQ2菌36 h。如图5所示,pH为3时,微生物OD600值仅为0.214,CX去除率为33.25%。随着pH的升高,OD600值和CX去除率都是先升高再降低,在pH为7.0时OD600达到最大值1.281,CX去除率达到100%。pH值过高或过低影响酶的活性和细胞膜的通透性,不利于微生物的生长。在碱性pH下CX去除率要略高于酸性条件下,根据CX的理化性质如表3所示[17],这可能是由于CX具有典型的β-内酰胺环结构,在碱性条件下被·OH亲核攻击酰基-氧键导致β-内酰胺环开环形成水解产物,从而使得CX浓度更低[18]。说明CQ2菌的最适宜pH为7.0,这与黄倩萍等筛出的苍白杆菌属最适宜pH一致[19]

      Parameters ValueCX distribution at different pH values
      NameCX(Cephalexin)
      Chemical formulaC16H17N3O4S
      Molecular weight347.39
      CAS number15686-71-2
      pH(5 g·L−13.5~5.5
      IC50/μg·mL−156.38

      表 3  CX理化性质

      Table 3.  Physicochemical properties of cephalexin

    • 改变培养箱的转速,其他条件不变。如图6所示,在90、120、150、180 rpm转速下,OD600值始终在1.25左右,且去除率都在99%以上,这说明溶液混合强度对CQ2菌影响较小。转速150 rpm和180 rpm时微生物OD600略高于其他转速,测定不同转速下溶解氧数值均在0.2 mg/L左右,无显著性差异,所以不同转速可能通过均匀分布培养基中菌体和污染物以及加快传质来影响降解速率。实验结果表明转速对CQ2菌生长影响程度较小,综合考虑微生物生长速率和均质问题,选择150 rpm作为最佳转速。

      图  6  转速对微生物生长及CX降解效果的影响

      Figure 6.  Effect of rotation speed on microbial growth and CX degradation

    • 培养条件不变,改变微生物的接种量培养28 h。如图7所示,接种量为1vol%时,培养28 h后OD600值为0.845,CX去除率为83.25%;接种量增加到5vol%时,OD600值为1.402,CX去除率为100%;接种量继续增加至10vol%,OD600值和CX去除率无明显变化。微生物进入新的环境后需要调整代谢,合成新的代谢酶和某些有机物,进入延滞期,而接种量主要与微生物的延滞期有关。有研究表明,接种量在7%-10vol%时菌液生长密度差异不大,接种量小于5vol%就会导致延滞期加长[2021]。本实验表明CQ2菌优化后的最佳接种量为5vol%。

      图  7  接种量对微生物生长及CX降解效果的影响

      Figure 7.  Effects of inoculation amount on microbial growth and CX degradation

    • 通过正交试验得到CQ2菌最优的培养条件,即温度30 ℃,pH为7.0,转速150 rpm,接种量为5vol%。为进一步研究CQ2菌对其他常见抗生素的降解性能,在该条件下,以阿莫西林(青霉素类)、土霉素(四环素类)、磺胺嘧啶(磺胺类)、培氟沙星(喹诺酮类)为目标降解物,初始浓度为10 mg/L,在无机盐培养基中培养36 h,测定剩余抗生素含量。如表4所示,CQ2对10 mg/L初始浓度的阿莫西林、土霉素和磺胺嘧啶均有一定的耐药性,但对培氟沙星抗生素较为敏感,OD600值由接种前的0.038降至接种后的0.027。所以CQ2菌对抗生素敏感程度依次为培氟沙星>磺胺嘧啶>土霉素>阿莫西林,且CQ2对阿莫西林的降解效果极佳,最佳条件下培养36 h可以对阿莫西林去除率达到100%。这可能是因为苍白杆菌染色体内含有特定的AmpC/R基因,能产生头孢菌素酶ApmC酶,因此对具有β-内酰胺环结构的阿莫西林和CX具有较强的耐药性[22]。细菌易对磺胺类药物产生耐药性,且葡萄糖上的C-6羟基被微生物氧化为羧基形成糖醛酸,能与磺胺类药物结合使其失活。随着降解实验的进行,反应环境不断酸化,土霉素在酸性或碱性条件下都不稳定,所以可能导致土霉素被分解。而培氟沙星是喹诺酮类抗生素,通过干扰DNA的复制和菌体蛋白质的合成来抑制细菌的活性,尤其是革兰氏阴性杆菌,对苍白杆菌具有较强的抑制性[23]

      Antibiotic speciesAmoxicillinTerramycinSulfadiazinePefloxacin
      OD6001.2980.9860.4120.027
      Antibiotic removal rate/%100.0062.3450.295.12

      表 4  CQ2菌对其他类抗生素去除率

      Table 4.  The removal rate of CQ2 bacteria to other antibiotics

    • 提取CQ2菌降解CX 24 h时的培养液,经过0.22 μm滤膜处理后采用LC-MS/MS对中间产物进行分析,结果如图8所示。通过Xcalibur软件对质核比(m/z)分析比对,在产物中检测到m/s=348.10、152.07、158.03、131.07、366.11、176.04、320.12、106.07、219.08等多种物质,再通过MS2的图谱分析,推测其结构式分别为CX、BD1-1、BD3-2、BD4、HD1、BD2-2、BD5、BD7-1、BD7-2,推测CX降解的路线包括直接生物降解和水解后生物降解。直接生物降解的产物主要是BD1-1和BD1-2,这也是产物中检测浓度相对较高的有机物,所以推测这是CQ2降解CX的主要路径,可能与微生物产生的青霉素酰化酶有关[24],且产物BD1-1可能会脱羧形成BD7-1,BD7-2进行分子内加氢生成BD7-2。CX分子中的四元环易发生水解导致开环生成 HD1,有研究表明β-内酰胺类抗生素的矿化过程是生物和非生物相结合的过程,而水解产物只会短暂的积累,再进一步降解为其他代谢物[25]。CX分子水解后脱羧形成BD5,分子自身的氨基和羧基脱水形成一个新的六元环BD6[26]。HD1中含硫六元环可能会被开环生成BD2-1和BD2-2;另一方面,产物中检测到相对较多的BD3-1(2-羟基-3-苯基吡嗪),这是由HD1侧链上的胺分子内攻击形成,推测这是CX水解后生物降解的主要路径,作为CX的降解产物BD3-1在很多文献中被报道[10, 27, 28],BD3-2中含氮双键发生断裂,氮被羟基取代,甲硫基被甲基取代生成BD4。随着培养时间的增长,这些初步降解产物可能会被进一步降解成其它未知物质,如产物中检测到部分乙酸和碳酸,虽然在只含葡萄糖的培养液中也能检测到,但不排除这是CX降解产物进一步矿化形成,也是随着微生物生长溶液pH下降的原因。

      图  8  CQ2菌生物降解CX的初步途径

      Figure 8.  Preliminary biodegradation of CX by CQ2 bacteria

    • (1)本研究分离出一株能高效降解抗生素CX的菌株CQ2,经16S rDNA基因序列鉴定,该菌株系苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)。

      (2)实验条件下,CQ2菌对CX降解效果优异,最佳培养条件为温度30 ℃,pH为7.0,转速150 rpm,接种量5vol%。该条件下培养28 h,对CX的降解率可达100%。

      (3)CQ2菌在最优条件下,对阿莫西林(青霉素类)、土霉素(四环素类)、磺胺嘧啶(磺胺类)、培氟沙星(喹诺酮类)抗生素的36 h去除率分别为100%、62.34%、50.29%、5.12%,表明CQ2对阿莫西林也具有较好的去除效果,但对培氟沙星耐药性较差。

      (4)基于降解中间产物的鉴定提出了CQ2菌降解CX可能的初步路径。推测了CQ2降解CX主要的两条路径为直接生物降解和水解后生物降解,其中直接生物降解为主要降解途径;2-羟基-3-苯基吡嗪为水解后生物降解主要降解中间产物。

(8)  表(4) 参考文献 (28) 相关文章 (14)

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