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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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基于能量循环再生系统酶法生产谷胱甘肽

    作者简介: 张 星(1992—),男,安徽人,博士生,从事酶筛选和级联反应催化的研究。E-mail:xxgzhang@163.com;
    通讯作者: 李志敏, lizm@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: Q814.2

Enzymatic Synthesis of Glutathione Based on Energy Regeneration System

    Corresponding author: Zhimin LI, lizm@ecust.edu.cn
  • CLC number: Q814.2

  • 摘要: 通过构建双酶级联反应,偶联多聚磷酸激酶(PPK)和谷胱甘肽双功能合成酶(GshF),以多聚磷酸(polyP)为能量供体,酶法合成了谷胱甘肽(GSH)。对GshF和PPK诱导表达条件优化,低温18 ℃有利于蛋白的可溶表达。将GshF和PPK纯化后,建立纯酶反应系统,对反应条件优化,结果表明,当polyP和MgCl2的浓度之比为30 : 45、腺苷磷酸(ADP)浓度为0.5 mmol/L时,反应效率较高;45 ℃为反应最优温度;在PPK质量浓度为4 g/L,GshF质量浓度为1 g/L时,3 h内GSH产量达到了58 ± 3.3 mmol/L,达到文献报道的最高生产水平。
  • 图 1  诱导温度对(a)GshF和(b)PPK表达的影响

    Figure 1.  Effect of induced temperatures on the expression of (a) GshF and (b) PPK.

    图 2  GshF和PPK的纯化

    Figure 2.  Purification of GshF and PPK

    图 3  GshF和PPK偶联合成GSH

    Figure 3.  GSH synthesis by coupling GshF and PPK

    图 4  不同polyP/MgCl2浓度对GSH合成的影响

    Figure 4.  Effect of the concentration ratio of polyP to MgCl2 on the synthesis of GSH

    图 5  不同ADP浓度对GSH合成的影响

    Figure 5.  Effect of the concentration of ADP on the synthesis of GSH

    图 6  温度对GSH合成的影响

    Figure 6.  Effect of temperature on the synthesis of GSH

    图 7  PPK/GshF酶比例对GSH合成的影响

    Figure 7.  Effect of ratio of PPK to GshF on the synthesis of GSH

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-08-06
  • 网络出版日期:  2019-12-13

基于能量循环再生系统酶法生产谷胱甘肽

    作者简介:张 星(1992—),男,安徽人,博士生,从事酶筛选和级联反应催化的研究。E-mail:xxgzhang@163.com
    通讯作者: 李志敏, lizm@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237

摘要: 通过构建双酶级联反应,偶联多聚磷酸激酶(PPK)和谷胱甘肽双功能合成酶(GshF),以多聚磷酸(polyP)为能量供体,酶法合成了谷胱甘肽(GSH)。对GshF和PPK诱导表达条件优化,低温18 ℃有利于蛋白的可溶表达。将GshF和PPK纯化后,建立纯酶反应系统,对反应条件优化,结果表明,当polyP和MgCl2的浓度之比为30 : 45、腺苷磷酸(ADP)浓度为0.5 mmol/L时,反应效率较高;45 ℃为反应最优温度;在PPK质量浓度为4 g/L,GshF质量浓度为1 g/L时,3 h内GSH产量达到了58 ± 3.3 mmol/L,达到文献报道的最高生产水平。

English Abstract

  • 谷胱甘肽(Glutathione,GSH),是由L-谷氨酸(L-Glu)、L-半胱氨酸(L-Cys)和甘氨酸(Gly)通过肽键连接而成的活性巯基化合物。GSH在生物体内,具有抗氧化、保护细胞和解毒等功能[1]。作为药物、食品和化妆品添加剂,也广泛应用于医药和轻工领域[2-3]。目前,GSH的生产方法主要包括化学法和生物法。生物法合成GSH具有反应条件温和、成本低以及环境污染少等优点。生物法又可分为发酵法和酶法。发酵法生产GSH,存在着底物和产物降解,副产物竞争和下游分离困难等缺点,使得GSH的生产效率不高[4]。相比于发酵法,酶法生产体系因为组分简单,底物与酶更易接触,具有周期短、易操作和得率高等优点[5]

    GSH的生物合成途径是通过两步依赖腺苷三磷酸(ATP)的反应合成,首先,L-Glu和L-Cys由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化,生成二肽γ-谷氨酰半胱氨酸,再经GSH合成酶催化,在γ-谷氨酰半胱氨酸的C端残基加上甘氨酸形成GSH[6]。谷胱甘肽双功能合成酶(GshF)是近年来发现的新型酶,在ATP和Mg2+或Mn2+存在下,具有可以同时催化GSH两步反应的活性[7-8],这极大地推进了GSH生物合成的研究进展。酶法生产GSH,一般需要在体系中直接添加价格昂贵的ATP,使得生产成本大大增加,限制了酶法生产的大规模应用。多聚磷酸激酶(PPK)是可以用于ATP再生的一种激酶,利用底物多聚磷酸(polyP)和腺苷二磷酸(ADP)可以催化合成ATP[9]。因为底物polyP价格低廉,性质稳定,在ATP依赖的反应中得到了广泛应用[10-11]。本文利用PPK和GshF纯酶建立级联反应,利用polyP代替GSH合成反应中需要添加的ATP,酶法合成JGSH;同时对酶的表达条件、系统反应条件包括底物浓度、温度和酶比例等优化后,达到了酶法高效生产GSH的目的。

    • 来源于菌株Thermosynechococcus elongates的PPK和Streptococcus sanguinis的GshF的重组质粒均由本实验室之前工作构建,并保存于大肠杆菌Rosetta2(DE3)中[12]。ADP、GSH和polyP购自美国Sigma-Aldrich公司,蛋白胨和酵母粉购自英国OXOID公司,其他试剂均购自上海麦克林生化科技有限公司。试剂纯度为分析纯或更高纯度。

    • 取含有表达质粒的菌株,按2%接种量接入3 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中,在37 ℃、220 r/min培养7 h,然后转接至50 mL LB培养基中,在37 ℃培养至OD600值达到0.6~0.8之间,加入终浓度为0.2 mmol/L异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,再转入不同温度下(18 ℃和37 ℃)培养至OD600为3~4。取500 μL(OD600约为3)培养的菌体于12 000 r/min,4 ℃离心10 min,用20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0,含250 mmol/L NaCl)洗涤1次后,重悬于500 μL上述缓冲液,冰水浴中超声破碎(功率200 W,工作2 s停4 s,90个循环)。最后将破碎细胞液于12 000 r/min、4 ℃离心20 min,取上清和沉淀进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE),分析蛋白表达情况。

    • 将最优诱导表达条件下的细胞收集破碎后,在8 000 r/min、4 ℃离心30 min,得到含有重组蛋白的上清液,利用Ni-NTA柱对蛋白进行亲和层析纯化。用含有10~300 mmol/L咪唑的缓冲液梯度洗脱吸附在柱上的蛋白,SDS-PAGE检测各个梯度的蛋白洗脱纯度,收集纯度较高的蛋白洗脱液,离心浓缩后加入20-25%(W/V)的甘油置于−80 ℃保存。

    • 利用纯酶PPK和GshF构建GSH合成体系。标准体系组成(500 μL):200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5),50 mmol/L L-Glu,50 mmol/L Gly,50 mmol/L L-Cys,40 mmol/L MgCl2,1 g/L PPK,1 g/L SS,2 mmol/L DTT,2 mmol/L ADP,20 mmol/L polyP,45 ℃反应。按不同时间间隔取样50 μL,加入三氯乙酸(终浓度10%,w/v)终止反应,离心取上清利用HPLC测定GSH浓度。反应条件优化如下:在反应体系中加入不同浓度比的polyP∶MgCl2(20∶40,20∶60,30∶60,30∶45,30∶90,mmol/L∶mmol/L);在反应体系中添加不同浓度的ADP(0.5~4 mmol/L);初始pH 8.0时,考察不同温度(30~50 ℃)对反应的影响;当氨基酸底物为120 mmol/L,SS 为1 g/L时,考察不同PPK浓度(2~4 g/L)对反应的影响。

    • 细胞密度采用紫外/可见分光光度计在600 nm下检测样品吸光值。蛋白浓度利用购自北京天根生化科技有限公司的BCA试剂盒测定。GSH利用高效液相色谱检测:色谱柱为日本岛津公司的Wondasil C18柱(4.6 × 150 mm),流动相A为50 mmol/L KH2PO4与10 mmol/L 1-庚烷磺酸钠混合液(磷酸调节pH 3.0),流动相B为纯甲醇,流动相A和流动相B的体积比为95∶5,柱温30 ℃,紫外检测波长210 nm,流速0.6 mL/min。

    • 诱导温度对蛋白表达有着重要的影响,温度过高会使蛋白翻译较快,错误折叠率加大,容易生成包涵体,导致蛋白失活。GshF在不同温度下诱导表达的SDS-PAGE分析如图1(a)所示,在37 ℃和18 ℃的细胞破碎上清液中都可看到GshF的可溶表达,但在37 ℃的裂解液沉淀中可以明显观察到有部分不可溶蛋白,说明GshF在高温诱导时会形成少量包涵体。PPK在不同温度下的诱导如图(b)所示,在37 ℃和18 ℃诱导时都会形成较多的沉淀,但37 ℃表达时蛋白大部分都在沉淀中,上清液中几乎观察不到可溶蛋白,而在18 ℃表达条件下的上清液中可以观察到有可溶表达。说明PPK也在低温条件下容易产生可溶表达,因为低温表达时,蛋白翻译折叠较慢,易于可溶蛋白的生成。

      图  1  诱导温度对(a)GshF和(b)PPK表达的影响

      Figure 1.  Effect of induced temperatures on the expression of (a) GshF and (b) PPK.

    • 由于表达的GshF和PPK都带有组氨酸标签,因此可以通过镍离子柱亲和层析纯化。将18 ℃下诱导后破碎的细胞上清液过柱洗脱后,得到GshF和PPK的纯酶液。利用SDS-PAGE检测,电泳条带如图2所示。得到的蛋白条带均一,大小都在90 ku左右,与根据氨基酸序列推算的理论值一致。

      图  2  GshF和PPK的纯化

      Figure 2.  Purification of GshF and PPK

    • GshF和PPK合成GSH的原理如图3所示,GshF可以利用L-Glu,L-Cys和Gly合成GshF,这是一个耗能反应,需要ATP参与供能。传统的酶法催化需要直接加入ATP,极大的增加了生产成本,不利于大规模的生产。polyP作为能量供体,可以由PPK催化断裂磷酸酐键,降解的磷酸基团结合ADP生成ATP。当引入PPK催化的反应时,在体系中初始加入一定量的polyP和少量的ADP,即可达到代替GSH合成反应中需要添加的ATP的目的,让ATP和ADP在体系中循环再生、高效合成GSH。

      图  3  GshF和PPK偶联合成GSH

      Figure 3.  GSH synthesis by coupling GshF and PPK

    • PolyP作为能量供体,在体系内不断地被消耗,因此polyP的供给会直接影响到ATP的生成量,从而影响GSH的合成效率。但是高浓度的polyP会和MgCl2发生螯合反应,从而导致polyP的损失,同时GshF和PPK为MgCl2依赖的酶,Mg2+浓度的降低也会影响GshF和PPK的活性,因此合适比例的polyP和MgCl2对反应效率有着重要影响。如图4所示,当polyP为20 mmol/L时,MgCl2浓度分别为40 mmol/L和60 mmol/L时,60 mmol/L的MgCl2对体系产生了抑制作用。当polyP提高到30 mmol/L时,MgCl2分别为45、60和90 mmol/L时,MgCl2浓度越高,GSH生产效率也越低。可以看出,当polyP浓度一定时,MgCl2浓度越高,对反应的抑制效果越明显。实验中也发现,高浓度的polyP和MgCl2会形成白色沉淀。这些结果说明,过高的MgCl2浓度会引起与polyP的螯合反应,降低GSH的生产效率。当MgCl2都为60 mmol/L时,加入30 mmol/L polyP的体系生产效率比20 mmol/L polyP的体系提高约50%,因为30 mmol/L polyP时,增加了螯合后剩余的polyP的有效浓度。当polyP和MgCl2的浓度比例为30 : 45 (mmol/L : mmol/L)时,反应效率最高。这些结果说明了合适的polyP和MgCl2的比例确实会对催化效率起重要作用。

      图  4  不同polyP/MgCl2浓度对GSH合成的影响

      Figure 4.  Effect of the concentration ratio of polyP to MgCl2 on the synthesis of GSH

    • ADP是双酶反应体系中的关键辅因子,在两个反应之间起到桥梁作用。因此ADP浓度可能会对反应体系的催化效率产生较大影响。ADP也是反应底物中成本较高的底物之一,过多的ADP会增加系统的成本,不利于GSH反应的大规模应用。因此,ADP的初始浓度直接关系到GSH合成的催化效率和生产成本。对初始的ADP浓度进行优化结果如图5所示。初始ADP浓度从0.5 mmol/L增加到4 mmol/L,GSH的浓度逐渐下降,2.0 h时GSH的产量从15.4 mmol/L降到4.3 mmol/L,说明在此范围内,当ADP浓度为0.5 mmol/L时,反应的催化效率最高。底物ADP浓度的增加,GSH生产效率反而降低,说明过高的ADP浓度对GshF和PPK两酶偶联催化起到抑制作用,原因可能是ADP和polyP的催化通道在PPK结构上较近,因为ADP比长链的polyP柔性较强,过多的ADP会聚集在polyP的催化通道入口,从而降低了polyP被催化的活性[13]

      图  5  不同ADP浓度对GSH合成的影响

      Figure 5.  Effect of the concentration of ADP on the synthesis of GSH

    • 温度对酶反应催化有着重要影响,一定范围内,温度升高可以提高酶活性,从而增加催化速率。对游离酶体系的温度进行优化,结果如图6所示,在0.5 h内,50 ℃温度下GSH合成速率最快,达到23 mmol/(L·h)。PPK是来源于嗜热菌的酶,温度升高,可以加快ATP的生成速率,从而提高GSH的合成速率。在30 ℃条件下,GSH的合成速率最慢。因为PPK在低温下酶活性相对较低,同时根据本课题组研究,30 ℃时GshF酶活也会下降[12]。在37~45 ℃范围内,GSH的生产效率随着温度升高而升高。其中,在45 ℃条件下,2 h反应即达到最高点,相比于其他条件,反应速率和GSH浓度都最高,分别达到了19.5 ± 0.3 mmol/(L·h)和39 ± 0.5 mmol/L,得率达到了78%,为GSH催化的最适温度。偶联体系的最适反应温度偏高,与GshF和PPK的催化性质一致,因为二者的催化活性都随着温度的升高而提高[12]

      图  6  温度对GSH合成的影响

      Figure 6.  Effect of temperature on the synthesis of GSH

    • 在多酶催化体系中,不同的酶比可以影响反应体系中的各个级联反应速率,从而影响总反应速率和生产效率,因此,在GSH生产系统中,通过酶比的优化,可以平衡ATP的生成和消耗,从而提高反应效率。在体系中考察了PPK/GshF浓度比分别为4∶1,3∶1和2∶1时对反应的影响,为了防止底物氨基酸对反应的限制,在体系中将前体的浓度提高至120 mmol/L,如图7所示,在PPK浓度从2 g/L增加到4 g/L,GSH的催化效率也在不断增加,GSH的产量从45 ± 0.2 mmol/L增加到58 ± 3.3 mmol/L,反应速率从15 ± 0.03 mmol/(L·h)增加到19.3 ± 1.1 mmol/(L·h)。因为在双酶反应中,PPK为ATP合成反应,因此,增加PPK的浓度,可以使得ATP的再生速率增大,从而增加了总反应速率,提高GSH产量。这也说明体系中ATP的再生速率对总催化速率的限制作用。随着反应进行,GSH合成速率逐渐降低,导致半胱氨酸没有被进一步利用,可能是体系中polyP降解和GSH生成导致的pH的下降,使得PPK和GshF酶活降低,无法高效生产GSH[12]

      图  7  PPK/GshF酶比例对GSH合成的影响

      Figure 7.  Effect of ratio of PPK to GshF on the synthesis of GSH

    • 本文通过构建双酶级联反应,利用GshF偶联PPK酶法合成GSH。对GshF和PPK诱导表达条件优化,都在18 ℃下可溶表达量最高。对GshF和PPK纯化后,建立纯酶反应系统,优化反应条件,发现polyP/MgCl2浓度比在30∶45下,ADP浓度为0.5 mmol/L,反应温度为45 ℃时,反应速率最高。当PPK 4 g/L,GshF 1 g/L时,3 h内GSH产量达到了58 ± 3.3 mmol/L。Yu等报道了利用乙酸激酶再生ATP的系统生产GSH,3 h产量达到了59 mmol/L,是目前报道的GSH最高产量[14],但此系统所用的高能磷酸化合物为乙酰磷酸,价格昂贵,且不稳定。本研究中的底物polyP来源广泛,价格低廉,化学性质稳定,因此,建立的低成本、高效的酶法合成体系为GSH大规模生产应用提供了参考依据。

(7)  参考文献 (14) 相关文章 (20)

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