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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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茯苓多糖HPLC指纹图谱与免疫活性的相关分析

    作者简介: 肖 颖(1994—),女,云南人,硕士生,研究方向为天然产物的分离与分析。E-mail: 18721217870@163.com;
    通讯作者: 夏玮, xiawei1999@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: O657.7+2

Correlation Analysis between HPLC Fingerprint of Polysaccharides from Poria Cocos and Immunological Activity

    Corresponding author: Wei XIA, xiawei1999@ecust.edu.cn
  • CLC number: O657.7+2

  • 摘要: 通过高效液相色谱(HPLC) 图建立16 批不同产地茯苓多糖的指纹图谱,以NO 释放浓度为免疫活性指标,测定16 批茯苓多糖刺激处于对数生长期的小鼠巨噬细胞产生的NO 的浓度,并利用正交偏最小二乘分析,研究茯苓多糖单糖组成与免疫活性间的相关性。结果表明:茯苓多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖以及阿拉伯糖等8 种单糖组成;用不同浓度茯苓多糖刺激小鼠巨噬细胞,NO 释放浓度随着茯苓多糖浓度的增大而增大,且均高于空白对照组;茯苓多糖中各单糖对小鼠巨噬细胞释放NO 的浓度均有相关性,半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖及葡萄糖对小鼠巨噬细胞的免疫活性呈正相关,其中具有显著性贡献的是葡萄糖、半乳糖和甘露糖。
  • 图 1  16 批茯苓多糖的指纹图谱

    Figure 1.  Fingerprints of 16 groups of PCPs

    图 2  茯苓多糖完全酸水解产物的对照指纹图谱(a)及混合单糖标准品的高效液相图谱(b)

    Figure 2.  Control fingerprints of complete alid hydrolyzate of PCPs (a) and HPLC ofmixed monosaccharide (b)

    图 3  茯苓多糖不同质量浓度时细胞的相对存活率

    Figure 3.  Relative cell survival rate with the different mass concentration of PCPs

    图 4  小鼠巨噬细胞释放NO的浓度

    Figure 4.  Concentration of NO produced by mouse macrophage

    图 5  标准化回归系数

    Figure 5.  Normalized regression coefficient diagram

    图 6  茯苓多糖的VIP值

    Figure 6.  VIP of PCPs

    表 1  原材料批次与产地

    Table 1.  Sample batches and place of origin

    No. Source No. Source
    S1 Yunnan S9 Anhui
    S2 Yunnan S10 Anhui
    S3 Yunnan S11 Hubei
    S4 Yunnan S12 Hubei
    S5 Yunnan S13 Hunan
    S6 Anhui S14 Henan
    S7 Anhui S15 Sichuan
    S8 Anhui S16 Fujian
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    表 2  16 批茯苓多糖相似度分析结果

    Table 2.  Results of similarity of 16 groups of PCPs

    No. Similarity No. Similarity
    S1 0.983 S9 0.999
    S2 0.988 S10 0.981
    S3 0.995 S11 0.998
    S4 0.993 S12 0.999
    S5 1.000 S13 0.989
    S6 0.980 S14 0.989
    S7 0.998 S15 0.992
    S8 0.997 S16 0.982
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    表 3  16批茯苓多糖刺激RAW264.7细胞释放的NO浓度

    Table 3.  NO concentration of RAW264.7 cells from 16 groups of PCPs

    No. c (NO)/(μmol·L−1)
    50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL
    S1 15.5±1.3 16.4±0.6 19.9±1.2
    S2 18.8±0.6 21.2±1.2 23.1±1.0
    S3 15.5±1.4 16.1±0.5 18.4±0.7
    S4 16.1±0.6 18.3±1.0 24.1±0.3
    S5 15.3±1.1 16.2±0.8 18.6±0.8
    S6 15.3±0.9 18.5±1.1 20.7±1.4
    S7 16.3±0.6 16.5±0.7 18.3±0.5
    S8 15.4±0.7 15.9±0.8 18.2±0.8
    S9 16.2±0.3 17.7±1.2 20.1±0.7
    S10 15.4±0.6 16.1±0.6 18.9±0.8
    S11 17.0±0.7 18.7±0.9 21.1±1.0
    S12 15.6±1.0 18.7±0.8 19.4±1.0
    S13 14.1±0.7 17.0±0.8 18.6±0.4
    S14 14.0±0.7 16.4±0.5 17.5±0.5
    S15 13.6±0.5 16.3±0.2 17.0±0.7
    S16 15.9±0.7 16.4±0.5 18.1±0.4
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    表 4  PCPs色谱指纹图谱及免疫活性的数据矩阵

    Table 4.  Data matrices of chromatographic fingerprints of PCPs and immunological activity

    No. A c (NO)/
    (μmol·L−1)
    X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8
    S1 13 856.5 710.1 162.9 16 650.0 17 158.1 54.0 109.1 5 939.1 19.9
    S2 13 643.8 606.2 134.8 17 857.6 17 915.5 52.5 108.9 5 985.8 23.1
    S3 13 834.9 159.4 90.2 28 362.1 27 016.5 97.8 60.6 8 450.6 18.4
    S4 13 947.3 336.0 175.8 23 643.6 23 919.1 51.8 150.1 8 140.3 24.1
    S5 13 685.5 380.7 66.1 25 947.1 21 301.3 51.5 59.2 7 112.6 18.6
    S6 10 409.4 264.3 134.7 32 766.9 18 918.8 26.9 82.3 6 394.0 20.7
    S7 13 406.3 268.0 51.5 26 440.0 2 3817.9 32.9 94.6 8 175.6 18.3
    S8 14 974.0 304.4 70.8 29 635.8 26 673.3 18.5 86.8 9 335.2 18.2
    S9 13 141.4 272.1 151.8 27 574.5 19 634.8 69.3 79.7 6 631.6 20.1
    S10 9 421.3 434.1 308.9 30 370.8 16 528.8 37.7 129.2 5 558.6 18.9
    S11 10 837.9 415.3 155.5 25 705.7 18 511.2 64.7 122.9 6 184.7 21.1
    S12 11 501.7 502.3 135.2 23 003.1 16 830.6 106.2 111.3 5 680.6 19.4
    S13 12 743.5 669.3 120.8 29 216.4 16 378.2 63.9 93.1 5 722.9 18.6
    S14 13 911.3 586.1 45.7 18 429.7 18 533.2 50.0 52.6 6 066.0 17.5
    S15 12 453.0 594.9 78.3 27 423.4 16 348.2 80.8 53.5 5 332.9 17.0
    S16 14 241.0 737.4 83.9 16 863.5 16 228.9 70.2 46.8 5 244.6 18.1
    Independent variables(Ax1~Ax8) came from the common peaks of HPLC chromatographic fingerprints (X1—Man; X2—GlcN; X3—GlcA; X4—Glc; X5—Gal; X6—Xyl; X7—Ara; X8—Fuc). The c(NO) indicates the concentration of NO produced by mouse macrophages stimulated with 200 μg/mL PCPs
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    [19] 陈兰萍牛玉刚 . 基于多代理的微电网分区分布式最优潮流分析. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190523004
    [20] 郁枫杨帆熊智华 . 基于CCF-PLS的通讯系统异常根因分析. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20191128006
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-06-29
  • 网络出版日期:  2020-04-03

茯苓多糖HPLC指纹图谱与免疫活性的相关分析

    作者简介:肖 颖(1994—),女,云南人,硕士生,研究方向为天然产物的分离与分析。E-mail: 18721217870@163.com
    通讯作者: 夏玮, xiawei1999@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学化学与分子工程学院, 上海市功能性材料化学重点实验室,上海 200237

摘要: 通过高效液相色谱(HPLC) 图建立16 批不同产地茯苓多糖的指纹图谱,以NO 释放浓度为免疫活性指标,测定16 批茯苓多糖刺激处于对数生长期的小鼠巨噬细胞产生的NO 的浓度,并利用正交偏最小二乘分析,研究茯苓多糖单糖组成与免疫活性间的相关性。结果表明:茯苓多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖以及阿拉伯糖等8 种单糖组成;用不同浓度茯苓多糖刺激小鼠巨噬细胞,NO 释放浓度随着茯苓多糖浓度的增大而增大,且均高于空白对照组;茯苓多糖中各单糖对小鼠巨噬细胞释放NO 的浓度均有相关性,半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖及葡萄糖对小鼠巨噬细胞的免疫活性呈正相关,其中具有显著性贡献的是葡萄糖、半乳糖和甘露糖。

English Abstract

  • 茯苓(Poria cocos)是一种高等担子菌,寄生于松科植物的根茎上,埋于土壤下繁衍而成。茯苓是传统药食两用中药,有多个入药部位,药用茯苓指的是茯苓的干燥菌核,多为不规则、大小不一的白色块状。多糖是茯苓的主要成分,具有多种生物活性。根据分步提取的方法,可以从茯苓中分离出6 种多糖[1],分别命名为PCS1、PCS2、PCS3-I、PCS3-II、PCS4-I和PCS4-II。其中PCS1、PCS2 和PCS3-I 是含有D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-岩藻糖和D-木糖的杂多糖。PCS3-II、PCS4-I 和PCS4-II 主要由(1→3)-β-D-葡聚糖主链和少量(1→6)-β-D-葡聚糖支链组成[2]。茯苓多糖(PCPs)具有免疫调节的作用,有研究[3-5]发现,茯苓多糖不仅能促进小鼠T 细胞、B 细胞、树突状细胞和巨噬细胞的增殖以及增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力,还能刺激免疫细胞释放免疫因子,显著提高小鼠体液免疫和细胞免疫的能力。茯苓多糖无论是在药用临床领域还是食品保健品领域都具有广阔的应用前景。

    多糖的生物活性与多糖的糖基组成、糖苷键类型、糖基连接顺序、支链情况、相对分子质量以及特定的空间构象等有着密切的关系[6]。在研究单糖组成对免疫活性的影响时,不能仅凭单糖的含量判断,将含量较高的单糖成分认定为对免疫活性贡献最大的成分,而应该通过数学建模的方法将指纹图谱色谱峰与生物活性数据进行关联分析,从而研究各组分对生物活性的贡献大小。用于相关性分析的数学建模方法有很多,其中常用的是灰色相关度分析[7]、典型相关分析[8]、主成分分析[9]、多元线性回归分析[10]以及偏最小二乘法等[11]。正交偏最小二乘法在偏最小二乘法的基础上结合了正交信号修正法,消除了与因变量无关的数据信息,不仅提高自变量与因变量的相关性,而且使得整个模型更加简洁可靠[12]

    本文通过将茯苓多糖单糖组成的指纹图谱与小鼠巨噬细胞释放的NO 的量相结合,采用正交偏最小二乘回归分析的方法,建立色谱指纹图谱与免疫活性之间的相关性模型。通过单糖组成的差异来反映各多糖含量的差异,研究单糖组成与免疫活性的相关性,根据相关系数的大小研究影响免疫活性的关键特征成分,为建立茯苓的质量控制方法提供科学依据。

    • Agilent 1260型高效液相色谱(HPLC,安捷伦科技(中国)有限公司);VS-840-1 超净工作台(上海博讯实业公司);AE24 分析天平(梅特勒-托利多公司);R-201 旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);Multiskan FC 酶标仪(赛默飞世尔仪器有限公司);DHG-9123A 型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);HF90 二氧化碳培养箱(上海力申科学仪器公司);HHS6 恒温水浴(上海精宏实验设备公司);TL-18M 台式高速冷冻离心机(上海市离心机械研究所);Scient2-10N 冷冻干燥机(上海新芝生物科技股份公司)。

    • 乙腈(HPLC 级,Adamas 公司);无水乙醇(分析纯,天津大茂化学试剂厂);无水甲醇(分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司);三氟乙酸(TFA,Adamas 公司);三氯甲烷(分析纯,国药集团药业股份有限公司);衍生化试剂 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP,Adamas 公司)。单糖对照品:甘露糖(Man)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、岩藻糖(Fuc)、氨基葡萄糖(GlcN)和木糖(Xyl),均购于上海源聚生物科技有限公司;葡萄糖(Glc,上海化学试剂公司);半乳糖醛酸(GalA,Fluka 公司);葡萄糖醛酸(GlcA,Aladdin 公司);RPMI-1640 培养基(美国GIBCO 公司); 胎牛血清(美国GIBCO 公司); 磷酸盐缓冲液(美国GIBCO 公司);脂多糖(LPS)(美国Sigma 公司);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(美国Sigma 公司);一氧化氮检测试剂盒E1030(普利莱基因技术有限公司)。

    • 茯苓样品分别来源于云南、安徽、河北、河南、湖南、四川、福建等7 个产地,见表1

      No. Source No. Source
      S1 Yunnan S9 Anhui
      S2 Yunnan S10 Anhui
      S3 Yunnan S11 Hubei
      S4 Yunnan S12 Hubei
      S5 Yunnan S13 Hunan
      S6 Anhui S14 Henan
      S7 Anhui S15 Sichuan
      S8 Anhui S16 Fujian

      表 1  原材料批次与产地

      Table 1.  Sample batches and place of origin

    • 实验用细胞株:小鼠巨噬细胞系RAW 264.7,购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

    • 将茯苓烘干、粉碎、过筛后待用。按料液比(原料质量与溶剂体积之比,g/mL)1∶10加入体积分数为95%的乙醇溶液进行脱脂,在85 ℃的水浴锅中加热回流4 h。脱脂后滤渣置于烘箱中干燥。称取50 g滤渣,按料液比1∶10 加入500 mL的双蒸水,在90 ℃的水浴中提取2 次,提取时间为2 h,将滤液合并,浓缩至30 mL,然后加入4 倍体积的无水乙醇,混合均匀后放置在4 ℃的冰箱里过夜,使多糖沉淀下来。离心后去除上清液,冷冻干燥后得到茯苓多糖。

    • 取6 mg多糖样品于安瓿瓶中,加入2 mol/L TFA 2 mL,使其充分溶解。封管后在120 ℃的烘箱中水解4 h,冷却至室温,加入适量甲醇在40 ℃下减压旋蒸至干,重复此操作7~8 次,除去过量的TFA,得到水解产物,用双蒸水溶解后备用。

      配制1 mg/mL的混合单糖标准液,取水解后的样品和单糖标准液各0.5 mL,加入0.6 mol/L NaOH 溶液0.5 mL,混合均匀后,再加入0.5 mol/L PMP 的甲醇溶液1 mL,置于70 ℃烘箱中反应100 min。冷却至室温后用盐酸溶液中和,最后将中和后的溶液用氯仿萃取3次,弃去氯仿相,水相用0.45 μm微孔膜过滤后供HPLC 进样分析。

      采用Agilent 1260 HPLC仪进行分析,色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温35 ℃,进样量为10 μL,流动相为乙腈和0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8),其体积比为18∶82;检测器二级阵列管检测器(DAD),检测波长250 nm。

    • 分别取16 批不同产地的茯苓多糖各6 mg,按2.2节的方法获得不同产地茯苓多糖单糖组成的HPLC 谱图,将色谱数据依次导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A)软件,得到指纹图谱。

    • 将衍生化后的同一样品放置0、4、8、12、24 h后,测定单糖组成及含量,考察该方法的稳定性。

    • 对同一批次样品取5 份,分别进行水解、衍生化、中和萃取等操作,制备得到平行的5 份供试液,测定单糖组成及含量,考察单糖分析方法的重复性。

    • 取9 个单糖混合标准品的衍生溶液连续进样5 次,比较各个共有峰的保留时间和峰面积,考察仪器的精密度。

    • 取对数生长期密度为每毫升104个的RAW 264.7 细胞接种于96 孔培养板中,分成浓度分别为12.5、25、50、100、200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL共10 个剂量的茯苓多糖处理组和培养基培养的空白对照组,每个组别设置6 个复孔,各孔加液体积为200 μL;置于37 ℃、CO2 体积分数为5%的培养箱中孵育24 h 后,每孔加入30 μL MTT (0.5 mg/mL)的磷酸盐缓冲溶液,相同条件避光孵育4 h 后吸去各孔液体,加入200 μL 二甲基亚砜溶液溶解生成的结晶物,静置10 min 后,使用酶标仪于492 nm波长处测定各孔OD 值,计算细胞相对存活率。

    • 取对数生长期的RAW 264.7 细胞制成细胞悬液,密度为每毫升105个细胞,接种于96 孔板中,每孔200 μL,置于37 ℃、CO2体积分数为5% 的培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后吸去培养基,将茯苓多糖用培养基分别稀释为质量浓度50、100、200 μg/mL,每孔加入200 μL,每个浓度设4 个复孔,阳性对照组加入同体积0.1 μg/mL LPS(脂多糖),培养24 h。采用Griess 法测定NO 浓度:吸取50 μL培养基,之后加入50 μL Griess I试剂,静置后,加入50 μL Griess II试剂。用酶标仪测试492 nm处的吸光度(OD)。

    • 16批不同产地茯苓多糖构建的指纹图谱如图1所示。不同产地样品的液相色谱图相似度较高,有8个共有峰。将各批茯苓多糖色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A),以S1 药材的HPLC 图谱作为参照谱,采用mark 峰匹配的方法,选中所有共有峰,建立茯苓多糖的对照指纹图谱,见图2中a。通过和9 种单糖标准品混合液的衍生化色谱图(图2中b)比对,确定8 个共有峰分别为甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖。其中甘露糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖的含量较高,峰面积占比之和超过98%;而氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖和阿拉伯糖的含量很低。各产地茯苓多糖的单糖组成与对照指纹图谱相一致,但不同单糖的相对比例有较小差异。不同产地样品和对照指纹图谱的相似度分析结果如表2所示,相似度在0.980~1.000之间,表明各产地茯苓多糖之间差异较小,可以采用建立的指纹图谱评价茯苓多糖的质量。

      图  1  16 批茯苓多糖的指纹图谱

      Figure 1.  Fingerprints of 16 groups of PCPs

      图  2  茯苓多糖完全酸水解产物的对照指纹图谱(a)及混合单糖标准品的高效液相图谱(b)

      Figure 2.  Control fingerprints of complete alid hydrolyzate of PCPs (a) and HPLC ofmixed monosaccharide (b)

      No. Similarity No. Similarity
      S1 0.983 S9 0.999
      S2 0.988 S10 0.981
      S3 0.995 S11 0.998
      S4 0.993 S12 0.999
      S5 1.000 S13 0.989
      S6 0.980 S14 0.989
      S7 0.998 S15 0.992
      S8 0.997 S16 0.982

      表 2  16 批茯苓多糖相似度分析结果

      Table 2.  Results of similarity of 16 groups of PCPs

    • 单糖组成及含量的实验结果表明,样品各共有峰峰面积相对标准偏差(RSD) 小于4.2%,保留时间的RSD 小于2%,表明检测方法在24 h内具有良好的稳定性。

      用HPLC 分析单糖组成及含量,各共有峰峰面积的RSD 值小于6.2%,保留时间的RSD 值小于0.9%,表明检测方法的重复性良好。

      对9 个单糖混合标准品的衍生溶液连续进样5 次,比较各共有峰的保留时间和峰面积,各共有峰峰面积的RSD 小于0.12%,保留时间的RSD 小于1.4%,表明该仪器具有良好的精密度。

    • 采用MTT 法测定RAW 264.7 细胞的相对存活率,若细胞在一定浓度范围内的相对存活率≥85%,则认为该浓度范围的茯苓多糖没有细胞毒性。由图3可知,当茯苓多糖的质量浓度范围为0~600 μg/mL 时,RAW 264.7细胞的相对存活率在0.87~1.15 之间,该浓度范围内的茯苓多糖对RAW 264.7 细胞无细胞毒性,且当茯苓多糖质量浓度为 100~200 μg/mL 时,细胞的相对存活率>1,表现为促进细胞增长。

      图  3  茯苓多糖不同质量浓度时细胞的相对存活率

      Figure 3.  Relative cell survival rate with the different mass concentration of PCPs

    • NO 是体内重要的生物活性物质,不仅是细胞间、细胞内的信号分子,而且在免疫学上也具有重要的意义。它作为机体非特异性免疫系统的组成部分之一,起着免疫效应分子和免疫调节剂的作用。Griess 法是测定NO 浓度最常用的方法,测试结果如表3 所示,在茯苓多糖的质量浓度范围为50~200 μg/mL时,实验组细胞产生NO 浓度随茯苓多糖质量浓度的增加而增加。图4将实验组、空白组和阳性对照组细胞产生的NO 浓度进行对比,可见空白组细胞产生NO 浓度最低,为(12.96±0.50)μmol/L,阳性对照组(LPS)细胞产生的NO 浓度最高,为(27.86±0.84)μmol/L,质量浓度为100 μg/mL和200 μg/mL的茯苓多糖与空白组相比均有显著性(P<0.01),且各实验组NO 浓度均低于阳性对照组。对比不同产地茯苓多糖的免疫活性,可以看出云南、安徽等地的茯苓多糖刺激小鼠巨噬细胞后产生的NO浓度相对较高,免疫活性普遍优于其他产地的茯苓多糖。

      No. c (NO)/(μmol·L−1)
      50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL
      S1 15.5±1.3 16.4±0.6 19.9±1.2
      S2 18.8±0.6 21.2±1.2 23.1±1.0
      S3 15.5±1.4 16.1±0.5 18.4±0.7
      S4 16.1±0.6 18.3±1.0 24.1±0.3
      S5 15.3±1.1 16.2±0.8 18.6±0.8
      S6 15.3±0.9 18.5±1.1 20.7±1.4
      S7 16.3±0.6 16.5±0.7 18.3±0.5
      S8 15.4±0.7 15.9±0.8 18.2±0.8
      S9 16.2±0.3 17.7±1.2 20.1±0.7
      S10 15.4±0.6 16.1±0.6 18.9±0.8
      S11 17.0±0.7 18.7±0.9 21.1±1.0
      S12 15.6±1.0 18.7±0.8 19.4±1.0
      S13 14.1±0.7 17.0±0.8 18.6±0.4
      S14 14.0±0.7 16.4±0.5 17.5±0.5
      S15 13.6±0.5 16.3±0.2 17.0±0.7
      S16 15.9±0.7 16.4±0.5 18.1±0.4

      表 3  16批茯苓多糖刺激RAW264.7细胞释放的NO浓度

      Table 3.  NO concentration of RAW264.7 cells from 16 groups of PCPs

      图  4  小鼠巨噬细胞释放NO的浓度

      Figure 4.  Concentration of NO produced by mouse macrophage

    • 正交偏最小二乘回归是一种用于相关性分析的方法,它结合了典型相关分析、主成分分析以及多元相关分析的特点,适用于自变量存在自相关或样本数量较少时的数据分析,可以很好地弥补其他分析方法的不足。以各单糖峰面积(AX1~AX8,其中X1~X8分别表示甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖)作为自变量,NO 的释放量(Y)作为因变量,茯苓多糖色谱指纹图谱及免疫活性的数据矩阵见表4,将表4 中数据导入SIMCA 14.1 软件中采用正交偏最小二乘法进行数据分析[14],得到自变量的回归系数见图5,回归系数反映了每种单糖与免疫活性之间相关性的大小,系数的绝对值越大,说明相关性越大,系数的符号反映了自变量与因变量是呈正相关还是负相关[15]。拟合出回归方程为Y=1.59AX1−1.28AX2−0.54AX3+0.41AX4+3.32AX5−0.53AX6+1.89AX7−5.51AX8。由方程可知,各单糖含量与小鼠巨噬细胞产生NO 的浓度之间的相关性大小为:岩藻糖>半乳糖>阿拉伯糖>甘露糖>氨基葡萄糖>葡萄糖醛酸>木糖>葡萄糖。其中,半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖以及葡萄糖与免疫活性呈正相关,而岩藻糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和木糖与之呈负相关。图6 示出了茯苓多糖的VIP (Variable importance in projection)值,VIP值反映了自变量对因变量贡献的大小,一般认为VIP>1 的自变量对模型有显著性的贡献。在该模型中,葡萄糖、半乳糖和甘露糖的VIP值均大于1,说明其对刺激小鼠巨噬细胞释放NO 发挥重要作用。

      No. A c (NO)/
      (μmol·L−1)
      X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8
      S1 13 856.5 710.1 162.9 16 650.0 17 158.1 54.0 109.1 5 939.1 19.9
      S2 13 643.8 606.2 134.8 17 857.6 17 915.5 52.5 108.9 5 985.8 23.1
      S3 13 834.9 159.4 90.2 28 362.1 27 016.5 97.8 60.6 8 450.6 18.4
      S4 13 947.3 336.0 175.8 23 643.6 23 919.1 51.8 150.1 8 140.3 24.1
      S5 13 685.5 380.7 66.1 25 947.1 21 301.3 51.5 59.2 7 112.6 18.6
      S6 10 409.4 264.3 134.7 32 766.9 18 918.8 26.9 82.3 6 394.0 20.7
      S7 13 406.3 268.0 51.5 26 440.0 2 3817.9 32.9 94.6 8 175.6 18.3
      S8 14 974.0 304.4 70.8 29 635.8 26 673.3 18.5 86.8 9 335.2 18.2
      S9 13 141.4 272.1 151.8 27 574.5 19 634.8 69.3 79.7 6 631.6 20.1
      S10 9 421.3 434.1 308.9 30 370.8 16 528.8 37.7 129.2 5 558.6 18.9
      S11 10 837.9 415.3 155.5 25 705.7 18 511.2 64.7 122.9 6 184.7 21.1
      S12 11 501.7 502.3 135.2 23 003.1 16 830.6 106.2 111.3 5 680.6 19.4
      S13 12 743.5 669.3 120.8 29 216.4 16 378.2 63.9 93.1 5 722.9 18.6
      S14 13 911.3 586.1 45.7 18 429.7 18 533.2 50.0 52.6 6 066.0 17.5
      S15 12 453.0 594.9 78.3 27 423.4 16 348.2 80.8 53.5 5 332.9 17.0
      S16 14 241.0 737.4 83.9 16 863.5 16 228.9 70.2 46.8 5 244.6 18.1
      Independent variables(Ax1~Ax8) came from the common peaks of HPLC chromatographic fingerprints (X1—Man; X2—GlcN; X3—GlcA; X4—Glc; X5—Gal; X6—Xyl; X7—Ara; X8—Fuc). The c(NO) indicates the concentration of NO produced by mouse macrophages stimulated with 200 μg/mL PCPs

      表 4  PCPs色谱指纹图谱及免疫活性的数据矩阵

      Table 4.  Data matrices of chromatographic fingerprints of PCPs and immunological activity

      图  5  标准化回归系数

      Figure 5.  Normalized regression coefficient diagram

      图  6  茯苓多糖的VIP值

      Figure 6.  VIP of PCPs

    • (1)茯苓多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖以及少量的氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖、阿拉伯糖组成。通过水解并衍生,将16 批不同产地的茯苓多糖的HPLC 色谱图建立指纹图谱。相似度分析结果表明16 批样品的相似度很高,均在0.981~1.000 之间。

      (2)进行免疫活性的测定,各实验组NO 释放浓度均高于空白对照组,且NO 的释放浓度随着茯苓多糖浓度的增大而增大。

      (3)通过正交偏最小二乘法拟合出回归方程,根据自变量的回归系数可判断出半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖以及葡萄糖与小鼠巨噬细胞的免疫活性呈正相关;岩藻糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和木糖与免疫活性呈负相关,其中葡萄糖、半乳糖和甘露糖对免疫活性具有显著贡献。

      (4)本文初步研究了茯苓多糖指纹图谱与小鼠巨噬细胞NO 的释放量之间的关系,为科学地制定茯苓多糖的质量评价标准提供参考。

(6)  表(4) 参考文献 (15) 相关文章 (20)

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