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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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一株降解页岩气采出水耐盐菌的分离鉴定与特性

    作者简介: 金 艳(1980-),女,上海,高工,博士研究生,主要研究方向:工业废水处理。E-mail:13482518451@126.com;
    通讯作者: 于建国, jgyu@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: X703.1,X172

Identification and Research on Characteristics of a Salt-tolerant Bacteria for Shale Gas Produced Water Treatment

    Corresponding author: Jianguo YU, jgyu@ecust.edu.cn
  • CLC number: X703.1,X172

  • 摘要: 本研究以不同高盐废水和土壤样品为菌源,从中分离筛选出对页岩气采出水中有机物具有最佳降解效果的优势菌株,通过形态学观察、革兰氏染色和16SrDNA基因序列分析,鉴定该菌为芽孢杆菌,具有分解尿素的尿素酶,可产硫化氢,能水解利用淀粉,能还原硝酸盐。考察了不同因素对该菌株生长的影响,结果表明,菌株在NaCl质量分数为0%-8%下生长良好,属于中度耐盐菌;最佳pH值在5-7,最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为尿素。
  • 图 1  不同耐盐菌的TOD去除率

    Figure 1.  TOD removal rate of different salt-tolerant bacteria

    图 2  206BP菌株的菌落形态和液体培养基外观

    Figure 2.  The characteristics of 206BP bacterial colony and liquid medium

    图 3  206BP电镜扫描图

    Figure 3.  The SEM of 206BP

    图 4  (a)206BP菌株DNA条带;(b)206BP菌株PCR产物条带    

    Figure 4.  (a) The DNA result of 206BP; (b) The PCR result of 206BP    

    图 5  206BP的16SDNA系统发育树

    Figure 5.  The tree of 206BP

    图 6  206BP生长曲线

    Figure 6.  The growth curve of the 206BP

    图 7  不同盐度条件下206BP的生长曲线

    Figure 7.  The growth line on 206BP in different salty

    图 8  碳源对206BP生长的影响

    Figure 8.  Effects of carbon sources on growth of the 206BP

    图 9  葡萄糖浓度对206BP生长的影响

    Figure 9.  Effects of glucose concentration on growth of the 206BP

    图 10  不同氮源对206BP生长的影响

    Figure 10.  Effects of nitrogen sources on growth of the 206BP

    图 11  尿素浓度对206BP生长的影响

    Figure 11.  Effects of urea concentration on growth of the 206BP

    图 12  pH对206BP生长的影响

    Figure 12.  Effects of pH on growth of the 206BP

    表 1  废水水质

    Table 1.  Analysis of wastewater

    ItemsResults
    pH 8.6
    TDS(g·L−138.5
    TOC(mg·L−196.1
    NH3-N(mg·L−168.2
    Cl-(g·L−122.9
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    表 2  菌株206BP生理特征

    Table 2.  Physiological properties of strain 206BP

    Physiological properties206BP
    Gram staining+
    Urease assay test+
    H2S production test+
    Starch hydrolysis test+
    Indole test-
    Gelatin liquefaction test-
    Nitrate reduction test+
    注:“+”表示阳性;“-”表示阴性。
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-06-12
  • 网络出版日期:  2019-09-26

一株降解页岩气采出水耐盐菌的分离鉴定与特性

    作者简介:金 艳(1980-),女,上海,高工,博士研究生,主要研究方向:工业废水处理。E-mail:13482518451@126.com
    通讯作者: 于建国, jgyu@ecust.edu.cn
  • 1. 华东理工大学资源与环境工程学院,国家环境保护化工过程环境风险评价与控制重点实验室,上海 200237
  • 2. 中国石油工程建设有限公司西南分公司,成都 610041

摘要: 本研究以不同高盐废水和土壤样品为菌源,从中分离筛选出对页岩气采出水中有机物具有最佳降解效果的优势菌株,通过形态学观察、革兰氏染色和16SrDNA基因序列分析,鉴定该菌为芽孢杆菌,具有分解尿素的尿素酶,可产硫化氢,能水解利用淀粉,能还原硝酸盐。考察了不同因素对该菌株生长的影响,结果表明,菌株在NaCl质量分数为0%-8%下生长良好,属于中度耐盐菌;最佳pH值在5-7,最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为尿素。

English Abstract

  • 一般将含有大量有机物同时TDS在1-15%的废水称为高盐有机物废水[1],如农药、制药、制革、石油、石化和纺织等行业排放的一些生产废水,均具有此特征[2-4]。废水中的高盐度不仅会抑制微生物的代谢功能,还会影响处理效果,很多研究人员通过分离和富集得到耐盐菌去处理各种含盐废水[5-8]。页岩气采出水也属于难处理的高盐有机废水,其主要来源于页岩气压裂过程中的大量返排液[9],其中不仅含原有压裂液的化学物质,而且由于长时间接触地层岩石而混入大量悬浮物、油脂、天然放射性物质、重金属、酚类、酮类等多种污染物[10-12]。由于页岩气采出水各种污染物成分复杂,且含盐量高,如不进行合理的无害化处理,会对周围环境造成很大危害。生化法较之物理法和化学法有着经济、高效的优点[13],如果能筛选出降解页岩气采出水的高效耐盐菌,对经济有效地处理页岩气采出水具有重要作用。

    嗜盐微生物是一类新型的且应用前景广阔的微生物资源,其结构组成、生理特性和代谢途径极为特殊,一般情况下高盐浓度会引起质壁分离和细胞活性丧失,但嗜盐细菌在高盐环境下却能正常生存生长,一些极端耐盐菌甚至在非高盐条件下无法存活[14, 15]。由于耐盐微生物的投加能够改善盐度对微生物活性的抑制作用,大幅提高有机物的降解效果,其在高盐废水处理工艺中具有巨大的应用潜力[16, 17]。本研究筛选、分离出一株对页岩气采出水具有一定降解能力的耐盐菌,对此菌株进行一系列的生理生化鉴定及生长特性研究。

    • 七水硫酸亚铁(FeSO4·7H2O):AR,上海凌峰化学试剂有限公司;磷酸二氢钠(NaH2PO4):AR,国药集团化学试剂有限公司;氯化铵(NH4Cl):AR,国药集团化学试剂有限公司;氯化钠(NaCl):AR,国药集团化学试剂有限公司;六水氯化镁(MgCl2·6H2O):AR,国药集团化学试剂有限公司;氯化钾(KCl):AR,国药集团化学试剂有限公司;无水葡萄(Anhydrous glucose):AR,上海天莲化工科技有限公司;酵母膏(Yeast):AR,北京奥博星生物技术有限责任公司;琼脂(Agar):AR,广东环凯微生物科技有限公司。

    • 采用扫描电镜(ZEISS EVO18,卡尔蔡司光学有限公司,德国)对菌株形貌进行分析。采用TOC分析仪(elementar vario TOC,元素分析系统elementar公司,德国)分析处理前后废水中有机物浓度。分光光度计(MAPADA UV-6100s,美谱达仪器有限公司,中国)。采用恒温振荡培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、离心机等进行菌的分离与纯化。

    • 耐盐培养基:FeSO4·7H2O 0.05 g·L−1;NaH2PO4 0.45 g·L−1;NH4Cl 0.3 g·L−1;NaCl 40 g·L−1;MgCl2·6H2O 0.5 g·L−1;KCl 0.3 g·L−1;无水葡萄糖 1 g·L−1;酵母膏 0.2 g·L−1;其余为去离子水,pH 6.5~7。

      固体培养基:FeSO4·7H2O 0.05 g·L−1;NaH2PO4 0.45 g·L−1;NH4Cl 0.3 g·L−1;NaCl 40 g·L−1;MgCl2·6H2O 0.5 g·L−1;KCl 0.3 g·L−1;无水葡萄糖 1 g·L−1;酵母膏,0.2 g·L−1;琼脂 2%;其余为去离子水,pH 6.5~7。

      废水培养基:废水中添加氮,磷,氮源是尿素,磷源以K2HPO4,投加量为C∶N∶P=100∶5∶1。

    • (1)耐盐菌群初筛

      分别取10 g污泥样品和10 mL高盐废水样品于含有100 mL耐盐菌培养基的灭菌三角瓶中,30 ℃下振荡进行富集培养,5-7 d后再取10 mL加入100 mL耐盐菌培养基中继续富集培养,反复4-5个周期后,获得耐盐菌群。污泥样品共3种,包括海泥、气田采出水排放口污泥和碱减量高盐废水池底泥三种,废水样品共7种,包括页岩气返排液、气田水、煤化工高盐废水、精细化工高盐废水等。

      (2)耐盐菌纯化分离

      制作固体平板培养基,用接种环用涂布划线接种法将富集液接种至已灭菌的平板培养基中,至于30 ℃恒温培养箱中培养3-4 d,当培养基中长出菌落后,细心挑取不同菌落进行分别单菌落的反复划线培养,直到形成单一菌落。

      (3)高效降解耐盐菌筛选

      将分离出来的纯菌液,定量投加至待降解废水中,然后置于30 ℃的恒温振荡培养箱中,180 rpm,培养24 h后测量其COD。先进行离心处理,然后取上清液测COD。

    • 采用电镜对206BP菌进行形态观察。将菌液先进行预处理,然后进行喷金处理,再进行电镜扫描。

      电镜前预处理方法:取206BP培养菌液1 mL于1.5 mL的离心管,以10 000 rpm进行离心3 min,弃上清液,加900 μL ddH2O和100 μL甲醛,充分打散,静置25 min,以10 000 rpm进行离心3 min,弃上清液,再依次用30%、50%、70%、100%乙醇进行充分打散和离心去除上清液。

    • 取培养24 h之后的处于稳定期的206BP菌液,定量接种于高温灭菌后的不同NaCl盐浓度嗜盐培养基中,然后置于30 ℃的恒温振荡培养箱中,180 rpm,培养一定时间后,取样,用分光光度计于600 nm波长处测光密度值。

    • 取培养24 h之后的处于稳定期的206BP菌液,分别定量接种于待降解的废水中,然后置于30 ℃的恒温振荡培养箱中,180 rpm,培养24 h后测量其TOC/COD。

      TOC测试预处理:取样品进行12 000 rpm超速离心5 min处理后加入TOC测量管中。用10 mL去离子水加入TOC测量管中作为清洗液。选用TIC-TC模式进行自动测量和分析。

    • TOC测定方法采用TOC测定仪;氨氮采用纳氏试剂分光光度法;TDS采用重量法;氯离子浓度采用滴定法。

    • 研究废水取自四川省宜宾市境内,H24井页岩气采出水,其水质分析如表1。本废水COD相对比较高,含盐量高,并且以NaCl为主。

      ItemsResults
      pH 8.6
      TDS(g·L−138.5
      TOC(mg·L−196.1
      NH3-N(mg·L−168.2
      Cl-(g·L−122.9

      表 1  废水水质

      Table 1.  Analysis of wastewater

    • 采集气田采出水、页岩气返排液、煤化工高盐废水、精细化工中高盐废水等高盐废水水样和周边土样若干,通过富集、筛选、纯化,分离出47株可在8%NaCl体系中生长良好的耐盐菌。将这些菌株分别投加到页岩气压裂返排液中,进行降解实验,其结果如图1所示。

      图  1  不同耐盐菌的TOD去除率

      Figure 1.  TOD removal rate of different salt-tolerant bacteria

      由上图1可知,编号为CF3P、206BP、206B-H-W、206F-H-G、202B-H-W、CNM和CFP菌株的TOC去除率均能达到50%以上,其中206BP的降解效果最好,因此选取206BP菌株作为降解页岩气采出水的优势菌株,并对其生理化学特性进行分析。

    • 将206BP菌株接至选择性固体培养基平板上,观察菌落形态,如图2所示。在平板上培养3 d后,206BP菌株的单菌落形状呈圆形,菌落光滑,颜色为不透明淡粉色,直径约为2-3 mm。接种后的液体培养基在摇床中培养1 d后的菌液呈浑浊淡粉色,延长培养时间颜色无明显变化。

      图  2  206BP菌株的菌落形态和液体培养基外观

      Figure 2.  The characteristics of 206BP bacterial colony and liquid medium

    • 采用SEM观察得到的菌株形态,如图3所示,菌株细胞呈椭圆形,表面有不规整的凹凸状,直径大小约2.0 μm,产生芽孢直径大小约为0.3-0.6 μm。

      图  3  206BP电镜扫描图

      Figure 3.  The SEM of 206BP

    • 实验中对菌株206BP进行生理生化实验,结果见表2

      Physiological properties206BP
      Gram staining+
      Urease assay test+
      H2S production test+
      Starch hydrolysis test+
      Indole test-
      Gelatin liquefaction test-
      Nitrate reduction test+
      注:“+”表示阳性;“-”表示阴性。

      表 2  菌株206BP生理特征

      Table 2.  Physiological properties of strain 206BP

      实验结果表明,该菌株为革兰氏染色阳性菌,具有分解尿素的尿素酶,可产生硫化氢气体,能够水解利用淀粉,不能分解蛋白质中色氨酸生成吲哚,不能液化明胶,可还原硝酸盐。

    • DNA提取:试验中菌株总DNA(图4),条带整齐明亮,无降解现象。PCR后,在1000 bp左右处有明显的产物条带(图4),条带整齐明亮。

      图  4  (a)206BP菌株DNA条带;(b)206BP菌株PCR产物条带    

      Figure 4.  (a) The DNA result of 206BP; (b) The PCR result of 206BP    

      PCR结果分析:通过PCR扩增得到1000 bp左右条带,序列为:

      5’—CTCTGTCACCTCATGCGGCTGGCTTCAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGGGATTGGCTAAACCTCGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCATCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCAAATATCTACGCATTTCACCGCTACACTTGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACACGCTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGCGCCGCCCTATTC—3’

      对该基因进行Blastx分析,发现GenBank中该基因与其菌种的16S氨基酸序列相似性较高。

      选取与之相近的其它21菌种通过clustalw2.0建立系统发育树,结果如图5。系统发育分析显示:16SRNA与Bacillus purgationiresistens等菌种直系同源物具有最高的相似性,相似性达到99%,该菌属于芽孢杆菌属。

      图  5  206BP的16SDNA系统发育树

      Figure 5.  The tree of 206BP

    • 将206BP扩增繁殖后,按1:100的比例接种于含4%NaCl的培养基中,在30 ℃,180 rpm条件下振荡培养,间隔1-4 h取样,用分光光度计在波长600 nm处检测菌悬液的吸光度,绘制如图6的菌株生长曲线。

      图  6  206BP生长曲线

      Figure 6.  The growth curve of the 206BP

      图6可知,在4%NaCl浓度的培养基中,菌株206BP在0~5 h处于生长延滞期,5~22 h处于指数生长期,24 h之后达到稳定期,稳定期时间较长。

    • 嗜盐菌根据其对盐的依赖程度分为嗜盐菌以及耐盐菌,而根据具体耐盐程度不同又分为轻度耐盐菌,中度耐盐菌以及极端耐盐菌,中度耐盐菌在3-15% NaCl浓度范围内可很好的生长[18],极端耐盐菌可在15-30% NaCl浓度范围内生长[19]。菌种在最佳耐盐条件下可以生长良好,并且进行正常繁殖,但是在非适宜条件下,就会影响其正常的生长及繁殖。实验中配置液体培养基NaCl浓度分别为0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%,测定206BP在不同盐浓度下的生长曲线,实验结果见图7

      图  7  不同盐度条件下206BP的生长曲线

      Figure 7.  The growth line on 206BP in different salty

      图7可知,在盐度为0%~20%条件下,206BP的生长情况差异明显,当盐浓度在0%~1%、5%~20%两个区间时,206BP生长至第14~16 h后才进入指数生长期,当盐浓度为8%时,直至第19 h时进入指数生长期,值得注意的是当在盐浓度大于10%条件下时,206BP的生长始终处于停滞期,生长缓慢甚至几乎不生长,而当盐浓度为2%~4%条件时,206BP在第12 h时即进入指数生长期,这与中度耐盐菌特性吻合,206BP菌株属于中度耐盐菌。

    • 实验中选取葡萄糖、草酸、可溶性淀粉、蔗糖、抗坏血酸、木糖、半乳糖、甘露糖和果糖为206BP菌株的唯一碳源,确定该菌株对不同碳源的转化利用情况,实验结果见图8

      图  8  碳源对206BP生长的影响

      Figure 8.  Effects of carbon sources on growth of the 206BP

      图8可知,206BP菌株对草酸的利用效果最差,在以草酸为唯一碳源时,菌株几乎不生长,接种培养24 h后,OD600只有0.028;菌株对抗坏血酸、可溶性淀粉和半乳糖的利用效果也不理想,接种培养24 h后,OD600分别为0.106、0.198、0.484;以葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖和木糖为唯一碳源时菌株生长良好,接种培养24 h后,OD600分别为1.045、0.965、1.086、1.042和0.889,其中果糖的OD600比葡萄糖的OD600略高,考虑到葡萄糖的成本比果糖低,选择葡萄糖为206BP菌株培养基的最佳碳源。

      实验同时测试不同葡萄糖浓度对菌株生长的影响,浓度分别为0、200、500、1 000、2 000、5 000 mg·L−1,实验结果见图9。不同浓度葡萄糖条件下,生长曲线中稳定期的OD600值随着葡萄糖浓度的上升而上升,碳源作为微生物的大量营养物,其浓度影响了菌株的生长总量。当葡萄糖浓度在0-2 000 mg·L−1时,生长曲线的停滞期时间基本相同,当葡萄糖浓度达到5 000 mg·L−1时,停滞期延长,进入指数期的时间较其他浓度条件推迟约5 h,表明当碳源浓度过高时也会对菌株生长有一定抑制作用。

      图  9  葡萄糖浓度对206BP生长的影响

      Figure 9.  Effects of glucose concentration on growth of the 206BP

    • 实验中选择NaNO3、NH4Cl、CH3CO2NH4、(NH4)2SO4和尿素为氮源进行最佳氮源实验,实验结果如图10

      图  10  不同氮源对206BP生长的影响

      Figure 10.  Effects of nitrogen sources on growth of the 206BP

      图10可知,206BP菌株对醋酸铵的利用效果最好,其次是对NH4Cl、尿素和(NH4)2SO4,对NaNO3的利用效果最差。在以醋酸铵为氮源时,生长曲线稳定期的OD600值明显更大,表明醋酸铵有助于菌株生长总量的增加,这主要是因为醋酸铵内含有一定比例的碳源。由于菌株对尿素、NH4Cl和(NH4)2SO4利用效率差不多,从经济成本考虑,选择尿素为最佳氮源,并考察不同氨氮浓度对菌株生长的影响,实验结果见图11

      图  11  尿素浓度对206BP生长的影响

      Figure 11.  Effects of urea concentration on growth of the 206BP

      图11可知,不同尿素浓度对菌株生长曲线的停滞期没有影响,不同尿素浓度时停滞期均为5 h左右,对指数期的生长速率略有影响,浓度高时生长速率大,对菌株生长总量也有一定影响,尿素不添加时,稳定期OD600低于含氮源条件下的值,菌株接种后培养到32 h时,尿素浓度为0、10、50、100、200、300、600、1 200 mg/L时对应的OD600分别为0.739、0.843、0.873、0.878、0.861、0.864、0.865和0.861,结果表明,当浓度增加到50 mg/L时,继续增加尿素浓度对菌株生长已经没有进一步的促进作用,因此选择尿素最佳浓度为50 mg/L。

    • pH是影响微生物生长的主要因素之一,实验中考察不同pH对206BP的生长影响,结果见图12,可生长的pH范围在5-8之间,当pH为5时,菌的进入指数期的时间会延后,但是一旦适应后,稳定期的OD600值比pH为7时还要高0.1,最佳pH为5-7。

      图  12  pH对206BP生长的影响

      Figure 12.  Effects of pH on growth of the 206BP

    • (1)以不同高盐废水和土壤样品为菌源,从中分离纯化出多株可耐高盐菌,并筛选出对页岩气采出水中有机物具有最佳降解效果的优势菌株,该菌株约2 μm,芽孢约0.3-0.6 μm,菌株为革兰氏染色阳性菌,具有分解尿素的尿素酶,可产生硫化氢气体,对淀粉能够水解利用,不能分解蛋白质中色氨酸生成吲哚,不能液化明胶,可还原硝酸盐和亚硝酸盐。

      (2)通过16SrDNA基因分析和构建系统发育树可知,206BP菌株的16SrDNA与Bacillus purgationir-esistens等菌种直系同源物具有最高的相似性,属于芽孢杆菌的一种,但是未找到一致序列,推断为芽孢杆菌新型菌株。

      (3)不同因素对优势菌株生长影响实验表明,该菌株在0%-8%NaCl浓度下生长良好,属于中度耐盐菌;最佳pH值在5-7,最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为尿素。

(12)  表(2) 参考文献 (19) 相关文章 (19)

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