高级检索

  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
引用本文:
Citation:

槲皮苷铜配合物作为P-糖蛋白抑制剂的研究

    作者简介: 邓 燕(1991-),女,山东人,硕士生,从事P-糖蛋白抑制剂的研究。E-mail:dengyanxinlang@sina.com;
    通讯作者: 郑静, zhengjing@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: R914; R965

Study on Cu-Quercitrin as a Novel P-gp Inhibitor

    Corresponding author: Jing ZHENG, zhengjing@ecust.edu.cn ;
  • CLC number: R914; R965

  • 摘要: P-糖蛋白(P-gp)是细胞产生多药耐药的主要原因之一,所以寻找有效的P-gp抑制剂是逆转P-gp介导的细胞多药耐药性的重要方法之一。以具有微弱P-gp抑制活性的天然槲皮苷为配体,合成了槲皮苷铜和槲皮苷锌配合物。结果表明,铜配合物能提高P-gp的底物罗丹明123和抗癌药物阿霉素在耐药细胞中的累积,同时增强了阿霉素的细胞毒性,表明铜配合物具有抑制P-gp的活性,而且它的抑制活性优于常见抑制剂维拉帕米;铜配合物对P-gp蛋白水平表达并没有影响,而是减少了细胞腺苷三磷酸的含量。这一研究表明结构多样、配体丰富的金属配合物有望成为有效的P-gp抑制剂。
  • 图 1  Cu-Quercitrin和Zn-Quercitrin的紫外吸收光谱(a),红外光谱(b)和化学结构(c)

    Figure 1.  UV-vis spectra (a), FT-IR spectra (b) of Cu-Quercitrin, Zn-Quercitrin and Quercitrin, and chemical structures of Cu-Quercitrin and Zn-Quercitrin (c)

    图 2  Rh123在MCF-7/ADR细胞内积累

    Figure 2.  Accumulation of Rh123 in MCF-7/ADR cells

    图 3  DOX在MCF-7/ADR细胞内的积累

    Figure 3.  Accumulation of DOX in MCF-7/ADR cells

    图 4  DOX和Rh123在MCF-7细胞内的积累

    Figure 4.  Accumulation of DOX or Rh123 in MCF-7 cells

    图 5  Cu-Quercitrin对DOX在MCF-7/ADR细胞中细胞毒性的影响

    Figure 5.  Effect of Cu-Quercitrin on cytotoxicity of DOX in MCF-7/ADR cells

    图 6  Cu-Quercitrin对P-gp在MCF-7/ADR细胞中表达的影响  

    Figure 6.  Effect of Cu-Quercitrin on the expression of P-gp in MCF-7/ADR cells

    图 7  Cu-Quercitrin对MCF-7/ADR细胞(a)和MCF-7细胞(b)中ATP含量的影响

    Figure 7.  Effect of Cu-Quercitrin on the ATP content in MCF-7/ADR (a) and MCF-7 (b) cells, the abscissa showed Cu-Quercitrin concentration

  • [1] SZÖLLŐS D, ROSE-SPERLING D, HELLMICH U A, et al. Comparison of mechanistic transport cycle models of ABC exporters[J]. Biochimica and Biophysica Acta, Biomembranes, 2017, 1860(4): 818-832.
    [2] ALLER S G. Structure of P-glycoprotein reveals a molecular basis for poly-specific drug binding[J]. Science, 2009, 323(5922): 1718-1722. doi: 10.1126/science.1168750
    [3] CALLAGHAN R, LUK F, BEBAWY M. Inhibition of the multidrug resistance P-glycoprotein: Time for a change in strategy[J]. Drug Metabolism & Disposition, 2014, 42(4): 623-631.
    [4] LI S, ZHANG W, YIN X, et al. Mouse ATP-Binding cassette(ABC) transporters conferring multi-drug resistance[J]. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 2015, 15(4): 423-432. doi: 10.2174/1871520615666150129212723
    [5] CROOP J M, GUILD B C, GROS P, et al. Genetics of multidrug resistance: Relationship of a cloned gene to the complete multidrug resistant phenotype[J]. Cancer Research, 1987, 47(22): 5982-5988.
    [6] YANG K H, WU J F, LI X. Recent advances in research on P-glycoprotein inhibitors[J]. Bioscience Trends, 2008, 2(4): 137-146.
    [7] WANG R, KUO C, LIEN L, et al. Structure-activity relationship: Analyses of p-glycoprotein substrates and inhibitors[J]. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 2003, 28(10): 203-228.
    [8] HOSSAM M. A, AHMED M A, RIHAM S E, et al. P-glycoprotein inhibitors of natural origin as potential tumor chemo-sensitizers: A review[J]. Journal of Advanced Research, 2015, 6(1): 45-62. doi: 10.1016/j.jare.2014.11.008
    [9] ALESSION T, CHRISTINE P, BERIYHARD K·K, et al. Anticancer metal drugs and immunogenic cell death[J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 2016, 165: 71-79. doi: 10.1016/j.jinorgbio.2016.06.021
    [10] BRUIJNINCX P C A, SADLER P J. New trends for metal complexes with anticancer activity[J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2008, 12(2): 197-206. doi: 10.1016/j.cbpa.2007.11.013
    [11] GUO Z, SADLER P J. Metals in medicine[J]. Angewandte Chemie International Edition, 1999, 38: 1512-1531. doi: 10.1002/(SICI)1521-3773(19990601)38:11<1512::AID-ANIE1512>3.0.CO;2-Y
    [12] RONCONI L, SADLER P J. Using coordination chemistry to design new medicines[J]. Chemical Reviews, 2007, 251(14): 1633-1648.
    [13] CHE C M, SIU F M. Metal complexes in medicine with a focus on enzyme inhibition[J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2010, 14: 255-261. doi: 10.1016/j.cbpa.2009.11.015
    [14] LOUIE A Y, MEADE T J. Metal complexes as enzyme inhibitors[J]. Chemical Reviews, 1999, 99: 2711-2734. doi: 10.1021/cr9804285
    [15] MEGGERS E. Targeting proteins with metal complexes[J]. Chemical Cammunications, 2009, 7(9): 1001-1010.
    [16] DYSON P J, SAVA G. Metal-based antitumour drugs in the post genomic era[J]. Dalton Transcation, 2006, 16: 1929-1933.
    [17] DARREN G, PARKER J P, MARMION C J. Enzyme inhibition as a key target for the development of novel metal-based anti-cancer therapeutics[J]. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 2010, 10: 354-370. doi: 10.2174/1871520611009050354
    [18] SAHNI S K, BENNEKOM R V, REEDIJK J. A spectral study of transition-metal complexes on a chelating ion-exchange resin containing aminophosphonic acid groups[J]. Polyhedron, 1985, 4(9): 1643-1658. doi: 10.1016/S0277-5387(00)87241-1
    [19] SARTAJ T, MEHVASH Z, MOHD A, et al. New modulated design and synthesis of quercetin-CuII/ZnII-Sn2 IV scaffold as anticancer agents: In vitro DNA binding profile, DNA cleavage pathway and Topo-I activity[J]. Dalton Transcation, 2013, 42: 10029-10041. doi: 10.1039/c3dt50646k
    [20] SHIRIN M, AMIRHOSSEIN S, FARZIN H, et al. Structural and functional aspects of P-glycoprotein and its inhibitors[J]. Life Sciences, 2018, 214(1): 118-123.
  • [1] 罗雪莉郎美东 . 聚合物前药载药性能的计算机模拟. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190514001
    [2] 刘状查如俊邵斐凌昊 . 石油树脂钻井液用页岩抑制剂的研制. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20191209003
    [3] 杨天骄王佳毅宋恭华 . 氮杂双环[3.3.1]壬烷芳基噻二唑类化合物合成及其对线虫的抑制活性研究. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.2018061400
    [4] 蔡昀盈吴梦琪夏玮宋金星张文清 . 甘草与厚朴复配物对变异链球菌及生物膜形成的抑制作用. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20191129002
    [5] 赵祥晴黄岩张维义岳志程振民 . 铜晶粒尺寸及其稳定性对醋酸乙酯加氢制乙醇的影响. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20181212004
    [6] 张津铭牟海川谢海芬 . 铜基大面积单晶双层石墨烯薄膜的化学气相沉积法快速生长. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20191111001
    [7] 殷红霞杨宇翔黄艳赵怡倪超英 . 氧化石墨烯功能化磁性空心球的制备及载药性能. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20180926001
    [8] 王兆东史炉炉赵红莉洪亚云周丽芳蓝闽波 . 可用于电子顺磁共振检测的pH响应载药胶束的制备与体外评价. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20180725001
    [9] 仲文博张敏章弘扬王月荣胡坪 . (6,5)单壁碳纳米管对盐酸阿霉素的载药性能. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20191122001
    [10] 刘秀军马骧 . 光响应型主客体超分子聚合物. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190312001
    [11] 郭妙吉金晶王行愚 . 基于多种灰度闪光刺激的P300脑-机接口性能研究. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20180330002
    [12] 陈剑挺叶贞成程辉 . 基于p阶Welsch损失的鲁棒极限学习机. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20181209001
    [13] 刘佳丽叶炯耀 . 基于Ohta颜色空间的多信息融合火焰检测. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20180910001
    [14] 杨祺刘士荣 . 多自主车辆队列跟随控制器设计. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190118001
    [15] 康萌萌杨浩谷小婧顾幸生 . 基于融合路径监督的多波段图像语义分割. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20191216002
    [16] 魏江平林家骏陈宁 . 多特征非接触式测谎技术. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190619002
    [17] 宋雅萍金玲管欣悦王朝锋李欣欣 . pH响应油水分离共聚物膜的合成及分离应用. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20181214002
    [18] 刘静丁艳玲刘小云谭正庄启昕 . 三亲性二嵌段共聚物共混体系的自组装行为. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190220001
    [19] 陈凯敏李凯郭旭虹 . 磁性聚合物刷的制备、功能化及其应用. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190527002
    [20] 徐浩川许妍霞孙泽于建国 . 磷酸三丁酯体系萃取分离磷酸中氟化物机理. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190430002
  • 加载中
图(7)
计量
  • 文章访问数:  123
  • HTML全文浏览量:  83
  • PDF下载量:  0
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2019-06-01
  • 网络出版日期:  2020-07-01

槲皮苷铜配合物作为P-糖蛋白抑制剂的研究

    作者简介:邓 燕(1991-),女,山东人,硕士生,从事P-糖蛋白抑制剂的研究。E-mail:dengyanxinlang@sina.com
    通讯作者: 郑静, zhengjing@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237

摘要: P-糖蛋白(P-gp)是细胞产生多药耐药的主要原因之一,所以寻找有效的P-gp抑制剂是逆转P-gp介导的细胞多药耐药性的重要方法之一。以具有微弱P-gp抑制活性的天然槲皮苷为配体,合成了槲皮苷铜和槲皮苷锌配合物。结果表明,铜配合物能提高P-gp的底物罗丹明123和抗癌药物阿霉素在耐药细胞中的累积,同时增强了阿霉素的细胞毒性,表明铜配合物具有抑制P-gp的活性,而且它的抑制活性优于常见抑制剂维拉帕米;铜配合物对P-gp蛋白水平表达并没有影响,而是减少了细胞腺苷三磷酸的含量。这一研究表明结构多样、配体丰富的金属配合物有望成为有效的P-gp抑制剂。

English Abstract

  • P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是一种能量依赖性药物外排泵,通过腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate,ATP)水解供能发挥转运作用[1]。为了防止机体对有害物质的吸收,P-gp可以介导细胞外源性物质的排出,从而保护一些重要组织和器官,这是机体在生理状态下的自身防御保护机制之一[2]。但是在P-gp过表达的癌细胞中,P-gp的转运外排作用也会将抗肿瘤药物逆浓度梯度泵出细胞外,导致细胞内药物浓度不断降低,这是癌细胞产生多药耐药性(Multidrug Resistance,MDR)的关键因素之一[3-4]。在过去20多年里,P-gp抑制剂的开发作为逆转P-gp介导的肿瘤细胞MDR的一个重要的方向,一直受到广泛关注[5]。到目前为止,P-gp抑制剂的开发已历经3代,但临床上使用的P-gp抑制剂的特异性不高,副作用较大,使治疗功效受到明显限制[6]。虽然许多天然产物,如黄酮类化合物,萜类化合物等都表现出P-gp抑制活性[7,8],但往往抑制活性较低。

    自顺铂抗癌活性被发现以来,金属配合物在医药领域的应用受到广泛关注[9]。金属离子的结构和化学性质多样性可以不断丰富候选药物库,给药物设计领域提供了众多可能性[10-12]。近年来,研究者对酶结构和功能等方面知识的丰富积累以及许多金属离子表现出对多种酶活性的特异性抑制活性 [13-16],极大地推动了具有酶抑制活性的新型金属药物的发展。目前,已开发出针对蛋白质脂质激酶、基质金属蛋白酶、端粒酶、拓扑异构酶和谷胱甘肽转移酶等活性抑制的金属配合物[17]

    相比于合成的小分子抑制剂,天然产物抑制剂虽然活性低,但是有它们自身的优势。为了提高天然产物P-gp抑制剂的活性,本研究以具有低P-gp抑制活性的黄酮类化合物槲皮苷为配体,通过金属离子与槲皮苷配位,合成槲皮苷铜配合物(Cu-Quercitrin)和槲皮苷锌配合物(Zn-Quercitrin)。研究表明槲皮苷铜配合物表现出较好的抑制P-gp活性,表明槲皮苷金属配合物在抑制P-gp转运,逆转细胞MDR方面具有潜在应用价值。

    • 槲皮苷(纯度98%),一水合醋酸铜(纯度99%),醋酸锌(纯度99%),无水甲醇(纯度99%)购于阿拉丁试剂有限公司;罗丹明123(Rhodamine 123,Rh123),阿霉素(Doxorubicin,DOX),维拉帕米均购于西格玛奥德里奇上海有限公司;RPMI 1640完全培养基购于赛默飞世尔科技有限公司;胎牛血清购于美国Gibco公司;噻唑蓝(MTT)试剂盒,ATP检测试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司;P-gp单克隆抗体和二抗购于艾博抗(上海)贸易有限公司。

    • 人乳腺癌耐阿霉素细胞MCF-7/ADR和人乳腺癌细胞MCF-7 购于中科院上海细胞库。RPMI 1640 用于MCF-7和MCF-7/ADR的培养,RPMI 1640培养基中额外补充体积分数为10% 加强新生牛血清及体积分数为1% 青霉素-链霉素溶液,MCF-7/ADR的培养需额外添加1 μmol/L DOX 以维持耐药性。细胞置于37 ℃,体积分数为5% CO2培养箱中培育。

    • 紫外可见光谱(UV-vis)使用Cary 50 型紫外分光光度仪测定;元素分析(EA)采用Elementar III Vario EI型分析测定;电感耦合等离子发射光谱(ICP-OES)采用Agilent 725型测定;红外光谱(IR)通过Bruker Vortex 10 型在波长范围在4 000~400 cm−1内测定;细胞毒性和ATP含量检测通过Biotek Synergy H1 型多功能酶标仪进行测定;细胞成像通过Nikon Eclips Ti-S 型荧光显微镜拍摄完成。

    • 称取一水合醋酸铜(0.08 mmol,17.8 mg)溶于8 mL水中,逐滴加入到槲皮苷(0.04 mmol,20 mg)的甲醇溶液(20 mL)中。将反应溶液加热至60 ℃,搅拌回流反应24 h,得到棕黄色浑浊液。过滤,滤渣用甲醇洗涤3次后真空干燥得到棕黄色产物16 mg,产率为50%。Anal. Cacl. for C27H36Cu2O19 : C 40.96%; H 4.58%; Cu 16.05%。Found: C 40.55; H 4.19; Cu 15.6。IR(KBr,ν): 3 391, 2 931, 1 624, 1 573, 1 476, 1 352, 1 270, 1 204, 1 092, 1 059, 995, 959, 810, 629 cm−1。UV(DMSO, 二甲基亚砜): 287 nm, 450 nm和675 nm。

      称取醋酸锌(0.08 mmol,14.7 mg)溶于8 mL水中,逐滴加入到槲皮苷(0.04 mmol,20 mg)的甲醇溶液(20 mL)中。将反应溶液加热至60 ℃,搅拌回流反应24 h,得到黄色浑浊溶液。过滤,滤渣用甲醇洗涤3次后真空干燥得到黄色产物6 mg,产率为20%。Anal. Cacl. for C25H32Zn2O19 : C 39.13%; H 4.20%; Zn 17.04%。Found: C 38.69; H 3.83; Zn 18。IR(KBr,ν): 3 408, 2 932, 1 622, 1 575, 1 476, 1 352, 1 271, 1 202, 1 089, 1 060, 996, 964, 807, 620 cm−1。UV(DMSO, 二甲基亚砜):270 nm, 431 nm。

    • 取干净的盖玻片置于24孔板中,用质量分数为0.1%的明胶包备4 h后,将MCF-7/ADR或MCF-7细胞以每毫升中1.5×105个的细胞密度分别接种于24孔板中,贴壁。分别加入浓度0,槲皮苷Quercitrin,槲皮苷金属配合物Cu-Quercitrin,Zn-Quercitrin和50 μmol/L 维拉帕米的无血清的MCF-7/ADR或MCF-7培养基,置于37 °C培养箱中共培育12 h,12 h后吸出培养基,加入10 μmol/L Rh 123或10 μmol/L DOX的无血清培养基共培育30 min。细胞经质量分数4%的多聚甲醛固定后制片并拍照。Rh123在蓝光激发下可以呈现出绿色荧光,DOX在绿光激发下可以呈现出红色荧光。

    • MCF-7/ADR细胞以每毫升中1.5×105个的细胞密度分别接种于96孔板中,24 h贴壁。分别加入浓度为0,10,30,50 μmol/L 的Cu-Quercitrin与MCF-7/ADR细胞共培育12 h后,0,30和50 μmol/L的DOX再共培育12 h。之后加入 20 μL 5 mg/mL的MTT溶液培育4 h,120 μL DMSO溶解紫色结晶后通过酶标仪检测570 nm处的吸光度AAtotalAblank), 其中,Atotal为实验组检测的吸收值,Ablank 为空白对照组(未生长细胞) 测定的吸收值。其中未加药组细胞存活率设为1,其570 nm处吸光值为A0,加药组各检测孔570 nm处吸光值为AA/A0即为MCF-7/ADR细胞的存活率。

    • 检测MCF-7/ADR细胞以每毫升中1×105个的细胞密度、毎孔2 mL分别接种于6孔板中,24 h贴壁。分别加入浓度为0,10,30,50 μmol/L的Cu-Quercitrin与MCF-7/ADR细胞共培育12 h后,置于冰上进行细胞裂解。细胞裂解物在4 °C、12 000 r/min离心5 min,取上清液。BCA蛋白检测试剂盒测定各个样品蛋白的浓度,根据测定的蛋白浓度,每个蛋白样品取10 μg的进样量,进行SDS-PAGE电泳(分离胶体积分数为8%)。然后,通过转膜装置将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。转膜结束后,取出PVDF膜,其中蛋白正面朝上,缓冲液(TBST)洗3次,每次10 min。再将膜置于质量分数为5% 的脱脂牛奶中进行封闭,在室温环境下缓慢摇动1 h。之后将膜置于体积比1:5 000稀释的P-gp一抗中,4 °C孵育过夜。一抗孵育后的PVDF膜用TBST清洗4次,每次5 min,再将膜置于体积比1:3 000稀释的二抗中,室温环境下孵育1 h。二抗孵育后的PVDF膜用TBST缓冲液洗涤5次,每次10 min,将膜上未结合的二抗清洗干净。PVDF膜经超敏ECL化学发光检测试剂盒显色,并置于暗室中显色进行拍照。

    • MCF-7/ADR和MCF-7细胞以每毫升中1×105个的细胞密度,毎孔2 mL分别接种于6孔板中,24 h贴壁。分别加入浓度为0,10,30,50 μmol/L 的Cu-Quercitrin及50 μmol/L 维拉帕米与细胞共培育12 h。12 h后,6孔板中每孔加入200 μL ATP检测裂解液,置于冰上进行细胞裂解。细胞裂解物在4 °C、12 000 r/min离心5 min,取上清液。通过ATP检测试剂盒在多功能酶标仪中检测蛋白中ATP含量。同时BCA蛋白检测试剂盒测定各个样品蛋白的浓度。

    • 在Excel中通过T-test进行统计学分析,其中*P; 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001(P为计算所得的统计学概率,Probability)。

    • 图1(a)所示为Cu-Quercitrin和Zn-Quercitrin溶解于DMSO中的紫外可见吸收光谱。配体槲皮苷在UV-vis区域内有两个重要吸收峰,其中357 nm处的吸收峰是来自槲皮苷中的肉桂酰共轭体系,260 nm处的吸收峰属于槲皮苷结构中苯甲酰共轭体系。从图中可以看出,Cu-Quercitrin吸收峰在287 nm和450 nm处,Zn-Quercitrin吸收峰在270 nm和431 nm处,即配体槲皮苷中苯甲酰和肉桂酰共轭体系的吸收峰均发生不同程度的红移,初步表明槲皮苷中苯甲酰共轭体系的羟基和羰基及肉桂酰共轭体系中邻酚羟基都参与金属离子配位。此外,Cu-Quercitrin在675 nm处有一个吸收峰,这个吸收峰属于Cu-Quercitrin中Cu2+八面体几何构型的特征吸收峰[18]。根据朗伯-比尔定律A = κbc,测得槲皮苷铜配合物Cu-Quercitrin在675 nm处的摩尔吸光系数λ为473 mol/(L·cm)。

      图  1  Cu-Quercitrin和Zn-Quercitrin的紫外吸收光谱(a),红外光谱(b)和化学结构(c)

      Figure 1.  UV-vis spectra (a), FT-IR spectra (b) of Cu-Quercitrin, Zn-Quercitrin and Quercitrin, and chemical structures of Cu-Quercitrin and Zn-Quercitrin (c)

      图1(b)所示为Cu-Quercitrin和Zn-Quercitrin的红外光谱,Cu-Quercitrin和Zn-Quercitrin分别在3 391 cm−1和3 416 cm−1有一个特征宽带,属于槲皮苷中OH基团和配位水分子中的O―H伸缩振动[19]。相比于槲皮苷在3 268 cm−1处羟基特征带,Cu-Quercitrin和Zn-Quercitrin的羟基特征峰分别向高频率移动了123 cm−1和148 cm−1,表明槲皮苷中邻酚羟基参与配位。另外槲皮苷中1 657 cm−1处的C=O在槲皮苷金属配合物Cu-Quercitrin和Zn-Quercitrin中分别转移到低频率的1 624 cm−1和1 622 cm−1处,表明槲皮苷中羰基氧原子参与配位。另外,C-O-C在1 270 cm−1处伸缩振动峰和C=C在1 573 cm−1处的伸缩振动峰并没有发生明显位移表明配体槲皮苷中环氧没有参与金属配位。Cu-Quercitrin和Zn-Quercitrin的化学结构见图1(c),其中两个水分子和甲醇分子参与Cu-Quercitrin的配位,四个水分子参与Zn-Quercitrin的配位。综上谱图特征说明Cu-Quercitrin和Zn-Quercitrin的化学结构非常相似,但是没有晶体结构,不能排除它们的立体结构有差异。

    • Rh123和DOX作为P-gp的底物,会通过P-gp转运而被排出细胞,在P-gp过表达的细胞中难以积累到一定浓度。按照,3.2节方法检测结果如图23所示。与对照组和Quercitrin实验组相比,Cu-Quercitrin处理的MCF-7/ADR细胞中Rh123和DOX的荧光强度有明显增强,并且增强趋势呈浓度依赖性,Cu-Quercitrin的作用浓度越高,细胞中Rh123和DOX的荧光越强。在Cu-Quercitrin的浓度为30 μmol/L和50 μmol/L 时,细胞中Rh123的绿色荧光和DOX的红色荧光明显强于配体槲皮苷和P-gp抑制剂作用的细胞。但是Zn-Quercitrin对Rh123和DOX在耐药细胞中积累的作用相对Cu-Quercitrin的积累作用较弱。这可能与两种配合物的立体结构有关。这些结果表明槲皮苷与铜离子配位后,其活性得到明显提高,Rh123和DOX在耐药细胞中积累明显增加。初步推测Cu-Quercitrin对P-gp转运可能具有抑制作用,且其抑制作用要强于P-gp抑制剂维拉帕米。

      图  2  Rh123在MCF-7/ADR细胞内积累

      Figure 2.  Accumulation of Rh123 in MCF-7/ADR cells

      图  3  DOX在MCF-7/ADR细胞内的积累

      Figure 3.  Accumulation of DOX in MCF-7/ADR cells

    • Cu-Quercitrin可以增加Rh123和DOX在耐药株MCF-7/ADR细胞中的积累,因此探究了Cu-Quercitrin对Rh123和DOX在野生株MCF-7细胞中积累的影响,实验结果如图4。结果表明Cu-Quercitrin对Rh123和DOX在MCF-7细胞中的积累没有明显影响。Cu-Quercitrin可以增加耐药株MCF-7/ADR细胞中Rh123和DOX的积累(图2图3),但不会影响在野生株MCF-7细胞中的积累,进一步表明Cu-Quercitrin可以明显抑制P-gp的转运功能。

      图  4  DOX和Rh123在MCF-7细胞内的积累

      Figure 4.  Accumulation of DOX or Rh123 in MCF-7 cells

    • 在细胞DOX荧光积累实验中发现Cu-Quercitrin可以明显增加DOX在MCF-7/ADR细胞中的累积,因此通过MTT实验检测Cu-Quercitrin对DOX在MCF-7/ADR细胞中细胞毒性的影响,实验结果如图5所示。实验结果如图5所示。对比黑色柱状形图可以看出Cu-Quercitrin单独处理的细胞中,随着Cu-Quercitrin作用浓度的增加,细胞存活率有所下降,但仍表现出较低的细胞毒性;在Cu-Quercitrin的浓度为0 μmol/L时的红色柱状图中可以看出DOX有较低的细胞毒性,这是基于MCF-7/ADR对DOX耐药性的结果。但是Cu-Quercitrin与MCF-7/ADR细胞共培育12 h后,DOX再作用于细胞时,细胞存活率有明显下降,且Cu-Quercitrin的浓度越高,细胞存活率越低。表明Cu-Quercitrin通过抑制P-gp转运功能,增加DOX在细胞中的积累,提高MCF-7/ADR细胞对DOX的敏感性,从而增强DOX在细胞内的累积毒性,缓解P-gp介导的细胞多药耐药。基于以上实验结果,在30 μmol/L浓度下Cu-Quercitrin表现出较强的P-gp转运功能的抑制作用和较低的细胞毒性,因此目前实验调节下Cu-Quercitrin的最优作用浓度为30 μmol/L/。

      图  5  Cu-Quercitrin对DOX在MCF-7/ADR细胞中细胞毒性的影响

      Figure 5.  Effect of Cu-Quercitrin on cytotoxicity of DOX in MCF-7/ADR cells

    • P-gp抑制剂一般是通过降低P-gp的蛋白水平、RNA水平的表达,或者通过影响细胞的ATP的含量,进而影响P-gp的转运功能[20]。MCF-7/ADR细胞与0,10,30和50 μmol/L的 Cu-Quercitrin共培育12 h后,裂解细胞并提取总蛋白。通过Western-Blot分离条带转膜后,Tanon化学发光照胶仪采集图像如图6(a),其中上面条带为目标蛋白P-gp,下面条带为内参蛋白Tubulin。图6(b)所示为Tanon Gis分析软件得出的条带分析结果。从图中可以看出Cu-Quercitrin对细胞中P-gp蛋白水平的表达没有明显影响,表明Cu-Quercitrin并不会通过影响P-gp蛋白水平的表达抑制P-gp转运功能。

      图  6  Cu-Quercitrin对P-gp在MCF-7/ADR细胞中表达的影响  

      Figure 6.  Effect of Cu-Quercitrin on the expression of P-gp in MCF-7/ADR cells

    • P-gp作为一种能量依赖的跨膜药物外输泵,在将外源性物质逆浓度从细胞内泵出细胞外的过程中需要ATP水解释放能量。因此,ATP对于P-gp的转运功能至关重要,一旦细胞内ATP含量发生变化,必然会影响P-gp的转运功能。例如P-gp抑制剂中GF-120918,LY-335979和XR9576等第三代抑制剂以及黄酮类化合物都可以通过影响ATP含量抑制P-gp药物转运功能[20]。因此,我们又考察了Cu-Quercitrin对细胞中ATP含量的影响。

      我们使用ATP检测试剂盒(ATP Assay Kit)检测了Cu-Quercitrin对细胞中ATP含量的影响。当用0,10,30,50 μmol/L的 Quercitrin,Cu-Quercitrin及50 μmol/L的维拉帕米与MCF-7/ADR和MCF-7细胞分别共培育12 h后,裂解细胞后提取总蛋白,测定ATP含量,结果如图7所示。从图7(a)中可以看出,与配体Quercitrin相比,Cu-Quercitrin可以明显降低MCF-7/ADR细胞中单位蛋白的ATP含量。随着培养基中Cu-Quercitrin浓度的增加,MCF-7/ADR细胞中单位蛋白的ATP含量逐步降低,而且明显低于使用同等浓度的P-gp抑制剂。与之对应的是Cu-Quercitrin对MCF-7细胞中ATP含量没有明显影响(图7(b))。这与Cu-Quercitrin能够影响P-gp底物在耐药细胞中的积累,但不会影响在非耐药细胞中的积累结果一致。与MCF-7细胞相比,耐药细胞MCF-7/ADR中P-gp往往过度表达,而P-gp结构中核苷酸结合位点参与ATP水解释放能量,进而推动P-gp的转运功能。这一结果表明Cu-Quercitrin可能通过降低耐药细胞中ATP含量,减少P-gp转运功能所需的能力,进而抑制其转运功能。

      图  7  Cu-Quercitrin对MCF-7/ADR细胞(a)和MCF-7细胞(b)中ATP含量的影响

      Figure 7.  Effect of Cu-Quercitrin on the ATP content in MCF-7/ADR (a) and MCF-7 (b) cells, the abscissa showed Cu-Quercitrin concentration

    • 本文合成了槲皮苷金属配合物Cu-Quercitrin和Zn-Quercitrin,探究了其P-gp抑制活性。Cu-Quercitrin可以明显增加P-gp底物Rh123和DOX在耐药细胞中的累积,但是对非耐药细胞没有明显影响。相比于Cu-Quercitrin,Zn-Quercitrin对Rh123和DOX在耐药细胞中积累的作用较弱。这一实验结果初步表明Cu-Quercitrin具有抑制P-gp转运功能的作用,而且其抑制作用比同等浓度的P-gp抑制剂强。同时Cu-Quercitrin增强DOX对耐药细胞的细胞毒性的实验结果也证明Cu-Quercitrin抑制P-gp药物外排功能,增加了抗癌药物在耐药细胞中的累积。进一步对Cu-Quercitrin抑制P-gp转运功能的机制研究中发现,Cu-Quercitrin对P-gp蛋白水平的表达没有影响,但是能降低耐药细胞中ATP含量,且降低趋势也明显高于P-gp抑制剂。因此,Cu-Quercitrin有望成为一种新型的P-gp抑制剂。

(7)  参考文献 (20) 相关文章 (20)

目录

    /

    返回文章