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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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氨基酸聚合物用于提高冻干过程中蛋白稳定性的研究

    作者简介: 李 冰(1993-),女,黑龙江人,硕士生,研究方向为高分子生物材料。E-mail:libingecust@163.com;
    通讯作者: 刘润辉, rliu@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: O6

Improving Protein Stability with Amino Acid Polymers during Lyophilization

    Corresponding author: Runhui LIU, rliu@ecust.edu.cn
  • CLC number: O6

  • 摘要: 为提高蛋白在冻干过程中的稳定性,采用双(三甲基硅基)氨基锂(LiHMDS)引发的超快速氨基酸环内酸酐(NCA)开环聚合方法,制备了聚L-赖氨酸(PLL)均聚物和聚L-谷氨酸(PLG)均聚物。以β-半乳糖苷酶(β-Gal)为模型蛋白检测氨基酸均聚物在冻干过程中对蛋白的保护效果,结果表明两种氨基酸均聚物的共混物对蛋白有保护效果,冻干后未添加氨基酸共混物保护剂的蛋白活性仅剩38%,添加氨基酸共混物保护剂的蛋白活性明显提升到77%,表明氨基酸共聚物能够在冻干过程中保护蛋白,显著提高蛋白稳定性。本文方法操作简单,可快速合成氨基酸聚合物并高效筛选蛋白稳定剂。
  • 图 1  Boc-L-Lys NCA合成路线

    Figure 1.  Synthetic route of Boc-L-Lys NCA

    图 2  tBu-L-Glu NCA合成路线

    Figure 2.  Synthetic route of tBu-L-Glu NCA

    图 3  L-赖氨酸合成路线

    Figure 3.  Synthetic route of PLL

    图 4  L-谷氨酸的合成路线

    Figure 4.  Synthetic route of PLG

    图 5  对叔丁基苄胺封端的PLL(a)和PLG(b)在脱保护状态下的核磁共振氢谱图

    Figure 5.  1H-NMR spectra of PLL (a) and PLG (b) on 4-tert-butylbenzylamine terminal functionalization at the deprotected stage

    图 6  加入PLL与PLG共混液并冷冻循环后β-Gal的活性(每个样品重复3次,**: p < 0.01)

    Figure 6.  Activity of β-Gal added PLL and PLG blending following lyophilization (n=3 for all samples, **: p< 0.01)

    图 7  PLL与PLG共混液对ONPG的反应活性

    Figure 7.  Reaction activity of PLL and PLG blending for ONPG

    图 8  PLL与PLG共混液对NIH 3T3成纤维细胞(a)和对HUVEC(b)细胞毒性的影响

    Figure 8.  Influence of PLL and PLG blending on NIH 3T3 fibroblast cells cytotoxicity (a) and HUVEC cytotoxicity (b)

    图 9  PLL与PLG共混液对人血红细胞的溶血活性

    Figure 9.  Hemolysis activity of PLL and PLG blending for human red blood cell

    表 1  PLL和PLG在侧链被保护状态下的1H-NMR和GPC表征结果

    Table 1.  1H-NMR and GPC characterization results of PLL and PLG at the sidechain protected stage

    PolymerDp,NMRGPC
    MnĐDp
    PLL1842281.1819
    PLG2341051.2322
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-04-22
  • 网络出版日期:  2019-05-23

氨基酸聚合物用于提高冻干过程中蛋白稳定性的研究

    作者简介:李 冰(1993-),女,黑龙江人,硕士生,研究方向为高分子生物材料。E-mail:libingecust@163.com
    通讯作者: 刘润辉, rliu@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,超细材料制备与应用教育部重点实验室,教育部医用生物材料工程研究中心,材料科学与工程学院,上海 200237

摘要: 为提高蛋白在冻干过程中的稳定性,采用双(三甲基硅基)氨基锂(LiHMDS)引发的超快速氨基酸环内酸酐(NCA)开环聚合方法,制备了聚L-赖氨酸(PLL)均聚物和聚L-谷氨酸(PLG)均聚物。以β-半乳糖苷酶(β-Gal)为模型蛋白检测氨基酸均聚物在冻干过程中对蛋白的保护效果,结果表明两种氨基酸均聚物的共混物对蛋白有保护效果,冻干后未添加氨基酸共混物保护剂的蛋白活性仅剩38%,添加氨基酸共混物保护剂的蛋白活性明显提升到77%,表明氨基酸共聚物能够在冻干过程中保护蛋白,显著提高蛋白稳定性。本文方法操作简单,可快速合成氨基酸聚合物并高效筛选蛋白稳定剂。

English Abstract

  • β-半乳糖苷酶(β-Gal)是糖苷水解酶(GH-A)超家族的成员,可以水解半乳糖苷内的糖苷键以释放半乳糖[1]β-Gal活性降低或缺失会导致消化乳糖能力下降。研究表明全球约有65%的人遭受乳糖不耐症的困扰[2],因此,β-Gal在乳制品行业中被广泛用于制造低乳糖和无乳糖的乳制品[3]。此外,β-Gal作为荧光探针的酶标,用于观察卵巢癌的转移,在遗传学治疗领域具有非常重要的意义[4]。蛋白质在水溶液中会受到含水制剂的活性分子对其化学以及物理稳定性的影响,所以需要将其通过冷冻干燥制成冻干粉,以便长期储存和使用。然而,在温度极低、浓度变化、低压操作、pH改变和干燥失水等条件下会导致蛋白失活和二级结构改变,因此在冷冻、干燥和再水化过程中维持β-Gal的结构、构象稳定性和活性仍然受到挑战,β-Gal在冻干前需加入蛋白质稳定剂以维持其在冷冻干燥过程中的活性。

    蛋白质稳定剂有氨基酸[5-7]、糖[8-10]、蛋白[11]、盐[12-13]、聚合物[14-21]等,氨基酸能够在冷冻状态下增加水的表面张力[7],蔗糖[22-23]、海藻糖[18, 24]等糖类可以保留蛋白质附近的水分子,其与蛋白质形成的氢键可以在冷冻干燥过程中稳定蛋白质。此外,聚合物如聚(乙二醇)[25]、聚(乙烯亚胺)[16]、羟丙基-β-环糊精[14]可用作添加剂以防止蛋白质的聚集和变性。

    本文选择两种单一手性L-氨基酸进行合成,并将其共混聚合物作为蛋白稳定剂。这是因为L-氨基酸不仅比外消旋氨基酸便宜而且容易降解成人体必需氨基酸;此外,根据水的替代机理,聚L-谷氨酸(PLG)能够与蛋白质形成氢键并在冻干过程中取代水分子以防止蛋白聚集[5, 7, 26];玻璃化转变机理也表明聚L-赖氨酸(PLL)的非晶结构可以降低蛋白玻璃化转变温度[27-28]。通过双(三甲基硅基)氨基锂(LiHMDS)引发的快速氨基酸环内酸酐(NCA)聚合,制备了PLG、PLL氨基酸聚合物,该聚合物具有对水分不敏感、反应速率快的特性,可用于快速筛选合适的蛋白保护剂[29-30]

    • L-谷氨酸-5-叔丁酯:纯度98%,阿拉丁试剂(上海)有限公司;-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸:纯度98%,上海迈瑞尔化学技术有限公司;三光气:纯度99%,北京伊诺凯科技有限公司;α-蒎烯:纯度99%,北京伊诺凯科技有限公司;β-半乳糖苷酶:5 000 U,阿拉丁试剂(上海)有限公司;2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG):纯度99%,阿拉丁试剂(上海)有限公司;LiHMDS:纯度99%,西格玛-奥德里奇(上海)贸易有限公司;DMEM培养液,GE医疗生命科学部;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT):纯度98%,上海麦克林生化科技有限公司;其他化学试剂均购于上海泰坦科技股份有限公司,使用前无进一步处理。

    • 核磁共振波谱仪(德国Bruker公司,AVANCE Ⅲ 400 MHz型):重水(D2O)为溶剂;凝胶渗透色谱:Waters 1515等强度HPLC泵;Waters 2414示差折光检测器(RI);东曹TSKgel Alpha-3000柱(粒径为7 µm);东曹TSKgel Alpha-2500柱(粒径为7 µm),柱温箱温度为50 °C,检测器温度为35 °C;流动相为含10 mmol/L溴化锂的二甲基甲酰胺(DMF),流速1 mL/min,标准样为聚甲基丙烯酸甲酯;酶标仪为Molecular Devices SpectraMax M2。

    • Boc-L-Lys NCA合成路线如图1所示[31]。在高纯氮气保护下,将-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(10.00 g,40.60 mmol)和α-蒎烯(16.98 mL,107.18 mmol)分别加入250 mL圆底烧瓶中。再加入干燥的四氢呋喃(THF)溶剂使单体悬浮。将三光气(5.30 g,17.86 mmol)提前溶解在干燥THF中,冰浴及氮气保护下将其注入上述圆底烧瓶中,使单体浓度为0.3 mol/L。将反应瓶转移至50 °C油浴锅里反应并保持2 h,点板监控反应结束后撤掉油浴,使用低温冷凝旋蒸除去多余THF并立即加入100 mL乙酸乙酯(EA),转移至500 mL的分液漏斗中,加入100 mL冰水萃取1次,收集有机相并用100 mL冷的饱和食盐水洗涤1次,无水硫酸镁干燥后过滤,使用干燥的EA和石油醚(PE)混合溶剂重结晶3次(EA与PE体积比为4∶5),在充满氮气的手套箱中过滤得到白色粉末状晶体5.30 g,产率为48%。

      图  1  Boc-L-Lys NCA合成路线

      Figure 1.  Synthetic route of Boc-L-Lys NCA

    • tBu-L-Glu NCA合成路线如图2所示[32]。在高纯氮气保护下,将L-谷氨酸-5-叔丁酯(5.00 g,24.60 mmol)和α-蒎烯(9.35 mL,59.04 mmol)分别加入250 mL圆底烧瓶中。再加入干燥的THF溶剂使单体悬浮。将三光气(2.92 g,9.84 mmol)提前溶解在干燥的THF中,冰浴及氮气保护下将其注入上述圆底烧瓶中,使单体浓度为0.3 mol/L。将反应瓶转移至50 °C油浴锅里反应并保持2 h,点板监控反应结束后撤掉油浴,使用低温冷凝旋蒸除去多余THF并立即加入100 mL EA,转移至500 mL的分液漏斗中,加入100 mL冰水萃取1次,收集有机相并用100 mL冷的饱和食盐水洗涤1次,无水硫酸镁干燥后过滤,使用干燥的EA和PE混合溶剂重结晶3次(EA与PE体积比为1∶2),在充满氮气的手套箱中过滤得到白色粉末状晶体3.10 g,产率为55%。

      图  2  tBu-L-Glu NCA合成路线

      Figure 2.  Synthetic route of tBu-L-Glu NCA

    • 以Boc-L-Lys NCA为单体,LiHMDS为引发剂,在手套箱里进行快速聚L-赖氨酸(PLL)的聚合反应,步骤如图3所示。称量Boc-L-Lys NCA(40.8 mg,0.15 mmol)放入干燥的10 mL反应瓶中,向瓶中加入0.1 mol/L LiHMDS的THF溶液(0.3 mL,0.03 mmol),调节单体浓度为0.1 mol/L,薄层层析(TLC)板监测反应结束后,滴加甲酸淬灭反应。用THF-石油醚沉淀体系,重复溶解-沉淀-离心过程3次,抽真空干燥后得到了一系列侧链带Boc保护的PLL均聚物。Boc保护基团用三氟乙酸(CF3COOH)脱除,再采用甲醇-无水乙醚沉淀体系,通过重复溶解-沉淀-离心过程3次得到用于提高蛋白稳定性的脱保护的PLL均聚物。

      图  3  聚L-赖氨酸合成路线

      Figure 3.  Synthetic route of PLL

    • tBu-L-Glu NCA为单体,LiHMDS为引发剂,在手套箱里进行快速聚L-谷氨酸(PLG)的聚合反应,步骤如图4所示。称量tBu-L-Glu NCA (103.15 mg,0.45 mmol)放入干燥的10 mL反应瓶中,向瓶中加入0.1 mol/L LiHMDS的THF溶液(0.45 mL,0.045 mmol),调节单体浓度为0.1 mol/L,TLC板监测反应结束后,滴加甲酸淬灭反应。采用THF-石油醚沉淀体系,重复溶解-沉淀-离心过程3次,抽真空干燥后得到了一系列侧链带tBu保护的PLG均聚物。tBu保护基团用CF3COOH脱除,再采用甲醇-无水乙醚沉淀体系,通过重复溶解-沉淀-离心过程3次得到用于提高蛋白稳定性的脱保护的PLG均聚物。

      图  4  聚L-谷氨酸的合成路线

      Figure 4.  Synthetic route of PLG

    • 将0.4 mg β-Gal溶解于1 mL磷酸盐缓冲溶液中,配制成0.4 mg/mL的蛋白溶液,取25 μL于250 μL的小离心管中,加入75 μL质量浓度为1.33 mg/mL的聚合物溶液,混匀置于液氮中冷冻5 min,再冻干12 h,待蛋白成为冻干粉后,加入100 μL超纯水溶解,混匀,取20 μL加入96孔板中,向其中加入50 μL显色剂2-硝基苯基- β - D -吡喃半乳糖苷(ONPG, 4 mg/mL),在暗处孵育5 min,再加入50 μL淬灭剂碳酸钠溶液(1 mol/L),用酶标仪测定405 nm波长下的吸光度,计算每个孔的蛋白活性值($\displaystyle\frac{{A _{405}^{{\rm{protein}}} - A _{405}^{{\rm{blank}}} }}{{A _{405}^{{\rm{control}}} - A _{405}^{{\rm{blank}}} }} \times {\rm{100}} \text{%}$),其中A405表示405 nm时的吸光度,blank表示空白组,control表示控制组。

    • 在96孔板中加入100 μL待测试的细胞悬浮液,使每个孔接种5 000个细胞,再将其置于含有5% (体积分数)CO2气氛的培养箱中,在37 °C培养24 h后用移液枪移除上层DMEM培养基,向底层长满细胞的孔中加入100 μL质量浓度为6.25~200 µg/mL的氨基酸共混物的DMEM溶液,继续置于CO2(体积分数为5%) 培养箱中在37 °C培养24 h,避光条件下,向每个孔中加入10 μL MTT溶液培养4 h。移除旧的DMEM培养基后再向孔中加入150 μL二甲基亚砜(DMSO),在摇床上轻微摇晃至紫色固体溶解,再用酶标仪测定570 nm波长下的吸光度,计算细胞存活率($\displaystyle\frac{{A _{570}^{{\rm{polymer}}} - A _{570}^{{\rm{blank}}} }}{{A _{570}^{{\rm{control}}} - A _{570}^{{\rm{blank} }}}} \times {\rm{100}} \text{%}$)。

    • 用人红细胞(hRBCs)对氨基酸聚合物进行溶血实验。将新鲜的人体血液用三乙醇胺缓冲盐水(TBS)稀释-离心沉淀并重复3次,然后稀释为5%(质量分数)的红细胞悬浮液,用TBS稀释氨基酸聚合物,使其质量浓度为1.56~200 µg/mL。然后在37 °C下孵育1 h。将96孔板离心5 min后,将80 μL上层清液小心转移到另一个96孔板中,用酶标仪测定405 nm波长下的吸光度值。计算溶血活性($\displaystyle\frac{{A _{405}^{{\rm{polymer}}} - A _{4050}^{{\rm{blank}}} }}{{A _{405}^{{\rm{control}}} - A _{405}^{{\rm{blank}}} }}$×100%)。

    • 聚合物的GPC表征结果如表1所示。通过GPC表征的数均分子量(Mn)可以计算聚合度(DP)。由表1可知PLL的分散性指数(Đ)为1.18,分子量分布较为均一,聚合度为19;PLG的分散性指数为1.23,聚合度为22。聚合反应结束后,取少量反应液在反应瓶中并加入对叔丁基苄胺继续反应12 h进行封端,用于核磁表征,结果如图5所示。通过苯上的氢确定均聚物的聚合度,PLL和PLG经对叔丁基苄胺封端后,由NMR表征的聚合度分别为18和23(表1),与GPC表征的结果相差不大,符合阴离子活性聚合的基本特征,且所得聚合物结构参数与单体投料比一致。

      PolymerDp,NMRGPC
      MnĐDp
      PLL1842281.1819
      PLG2341051.2322

      表 1  PLL和PLG在侧链被保护状态下的1H-NMR和GPC表征结果

      Table 1.  1H-NMR and GPC characterization results of PLL and PLG at the sidechain protected stage

      图  5  对叔丁基苄胺封端的PLL(a)和PLG(b)在脱保护状态下的核磁共振氢谱图

      Figure 5.  1H-NMR spectra of PLL (a) and PLG (b) on 4-tert-butylbenzylamine terminal functionalization at the deprotected stage

    • 以保存在4°C未被冻干破坏的新鲜的蛋白活性作为初始活性(100%),分别测试了PLL与PLG(质量浓度均为1.33 mg/mL)以不同质量分数共混后的共混物(以 x%PLL+y%PLG表示,x%,y%分别表示PLL和PLG的质量分数)在冻干条件下对蛋白的保护效果,结果如图6所示。不同质量分数的PLL与PLG共混对蛋白的保护效果不同,随着PLG质量分数的增加,保护效果逐渐增强。未被保护的β-Gal蛋白在经历冷冻循环后活性只剩下38%,20% PLL与80% PLG共混后,蛋白活性明显提升至77%,活性提高了39%,保护效果非常明显。有文献报道[5, 27-28],蛋白的冻干包括冷冻和干燥两个过程,在冷冻过程中,蛋白的pH会发生改变,此时氨基酸类聚合物可以与蛋白周围的水结合,来维持蛋白的三维构象。当蛋白被干燥时,氨基酸聚合物可以替代水分子,与蛋白表面的残基相互作用,进而维持其结构。蛋白表面有很多带电荷的残基,选用带正电荷的PLL与带负电荷的PLG以不同质量比进行共混,也可以平衡蛋白表面的电荷。

      图  6  加入PLL与PLG共混液并冷冻循环后β-Gal的活性(每个样品重复3次,**: p < 0.01)

      Figure 6.  Activity of β-Gal added PLL and PLG blending following lyophilization (n=3 for all samples, **: p< 0.01)

    • 采用酶标仪对蛋白与显色剂结合后的显色产物进行β -Gal的活性检测。为了排除氨基酸聚合物与显色剂反应对结果可能造成的干扰,将聚合物与显色剂混合,在暗处孵育后,在相应的波长处测试吸光度值,根据1.5节公式计算出相应的显色剂活性,结果如图7所示,结果表明PLL与PLG的共混液不与显色剂ONPG反应,可以确定显色剂仅仅显示蛋白的活性。

      图  7  PLL与PLG共混液对ONPG的反应活性

      Figure 7.  Reaction activity of PLL and PLG blending for ONPG

    • PLL与PLG共混液对成纤维细胞NIH 3T3和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞毒性如图8所示。由图可知,当PLL的质量分数不高于50%时,共混液中NIH 3T3和HUVEC的细胞存活率都维持在80%以上,随着PLL质量分数的增加,毒性总体上有所升高,细胞存活率有所下降,说明在PLL的质量分数不高于50%时,PLL与PLG共混液作为一种蛋白保护剂可应用于对体内蛋白的保护。

      图  8  PLL与PLG共混液对NIH 3T3成纤维细胞(a)和对HUVEC(b)细胞毒性的影响

      Figure 8.  Influence of PLL and PLG blending on NIH 3T3 fibroblast cells cytotoxicity (a) and HUVEC cytotoxicity (b)

    • 溶血活性是检测蛋白保护剂生物相容性的指标,溶血活性值过高将被限制用于体内。PLL与PLG共混液对人血红细胞的溶血活性如图9所示。当PLL的质量分数小于50%时,共混液对人血红细胞没有明显的溶血活性,当PLL的质量分数大于50%时,有部分人血红细胞被破坏。这个结果也与细胞毒性的测试结果相符。说明当PLL质量分数小于50%时,PLL与PLG共混液适合作为蛋白的保护剂。

      图  9  PLL与PLG共混液对人血红细胞的溶血活性

      Figure 9.  Hemolysis activity of PLL and PLG blending for human red blood cell

    • (1)以LiHMDS为引发剂,将Boc-L-Lys NCA和tBu-L-Glu NCA两种单体进行开环聚合,聚合反应可在10 min之内完成。

      (2)PLL与PLG的共混液对冻干过程中的β-Gal有很好的保护效果,20%PLL-80% PLG共混液保护下冻干后的蛋白活性(77%)与未加保护剂时的蛋白活性(38%)相比提高约1倍。 (3)PLL与PLG的共混液对NIH 3T3成纤维细胞和HUVEC细胞具有低毒性,对人血红细胞具有低溶血活性,表明其可用作体内的蛋白保护剂。

(9)  表(1) 参考文献 (32) 相关文章 (20)

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