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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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反应型甲醛小分子荧光探针进展

    作者简介: 徐清爽(1996-),女,河南南阳人,博士生,主要研究方向为荧光探针。E-mail:Y20180132@ecust.edu.cn;
    通讯作者: 郭志前, guozq@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: O6-1

Reaction-Based Formaldehyde Small Molecule Fluorescent Probes

    Corresponding author: Zhiqian GUO, guozq@ecust.edu.cn
  • CLC number: O6-1

  • 摘要: 甲醛是一种具有高度反应活性的羰基物种,基于其活性羰基与识别基团的反应类型对其进行分类,概述了NH2基团反应型、NHNH2基团反应型、Aza-Cope重排反应型以及待测物再生型甲醛荧光探针的反应机理 ,重点对再生型甲醛荧光探针的设计进行了亮点评述。从甲醛分子探针的设计理念、识别机理以及应用等方面进行了描述,最后对新型甲醛分子探针的设计与发展提出了展望。
  • 图 1  NH2取代基与甲醛反应机理

    Figure 1.  Reaction mechanism of NH2 substituted group with formaldehyde

    图 2  探针1的分子结构及其对甲醛的检测机理[5]

    Figure 2.  Molecular structure of probe 1 and detection mechanism of formaldehyde [5]

    图 3  探针2的分子结构及其对甲醛的检测机理[6]

    Figure 3.  Molecular structure of probe 2 and detection mechanism of formaldehyde [6]

    图 4  探针3的分子结构及其对甲醛的检测机理[7]

    Figure 4.  Molecular structure of probe 3 and detection mechanism of formaldehyde [7]

    图 5  探针4的分子结构及其对甲醛的检测机理[8]

    Figure 5.  Molecular structure of probe 4 and detection mechanism of formaldehyde [8]

    图 6  NHNH2与甲醛反应机理

    Figure 6.  Reaction mechanism of NHNH2 and formaldehyde

    图 7  探针5的分子结构及其对甲醛的检测机理[9]

    Figure 7.  Molecular structure of probe 5 and detection mechanism of formaldehyde [9]

    图 8  探针6的分子结构及其对甲醛的检测机理[10]

    Figure 8.  Molecular structure of probe 6 and detection mechanism of formaldehyde [10]

    图 9  探针7的分子结构及其对甲醛的检测机理[11]

    Figure 9.  Molecular structure of probe 7 and detection mechanism of formaldehyde [11]

    图 10  Aza-Cope重排反应机理

    Figure 10.  Aza-Cope rearrangement mechanism

    图 11  探针8的分子结构及其对甲醛的检测机理[12]

    Figure 11.  Molecular structure of probe 8 and detection mechanism of formaldehyde [12]

    图 12  探针9的分子结构及其对甲醛的检测机理[13]

    Figure 12.  Molecular structure of probe 9 and detection mechanism of formaldehyde [13]

    图 13  探针10的分子结构及其对甲醛的检测机理[14]

    Figure 13.  Molecular structure of probe 10 and detection mechanism of formaldehyde [14]

    图 14  探针11的分子结构及其对甲醛的检测机理[15]

    Figure 14.  Molecular structure of probe 11 and detection mechanism of formaldehyde [15]

    图 15  探针12的分子结构及其对甲醛的检测机理[16]

    Figure 15.  Molecular structure of probe 12 and detection mechanism of formaldehyde[16]

    图 16  探针13的分子结构及其检测机理[17]

    Figure 16.  Molecular structure of probe 13 and detection mechanism of formaldehyde [17]

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-02-26
  • 刊出日期:  2019-06-01

反应型甲醛小分子荧光探针进展

    作者简介:徐清爽(1996-),女,河南南阳人,博士生,主要研究方向为荧光探针。E-mail:Y20180132@ecust.edu.cn
    通讯作者: 郭志前, guozq@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学精细化工研究所,上海 200237

摘要: 甲醛是一种具有高度反应活性的羰基物种,基于其活性羰基与识别基团的反应类型对其进行分类,概述了NH2基团反应型、NHNH2基团反应型、Aza-Cope重排反应型以及待测物再生型甲醛荧光探针的反应机理 ,重点对再生型甲醛荧光探针的设计进行了亮点评述。从甲醛分子探针的设计理念、识别机理以及应用等方面进行了描述,最后对新型甲醛分子探针的设计与发展提出了展望。

English Abstract

  • 甲醛是最简单的醛类物质,化学性质活泼,容易和带有−NH2(氨基)、−OH(羟基)、−SH(巯基)基团的分子发生亲核加成反应。甲醛广泛应用于化工生产中的洗涤剂、塑料、木材加工、防腐剂、药品等领域[1]。环境中的甲醛主要来源于自然和人为的工业活动以及生物燃料的燃烧,接触高浓度的外源性甲醛会引起流泪、打喷嚏、咳嗽、恶心和死亡,甲醛已成为人类健康的一大威胁。2004年,国际癌症研究机构将甲醛重新分类为人类致癌物(IARC)[2]

    甲醛作为一种活性羰基物种(RCS),存在于人身体的各个部位,与内源性甲醛的代谢失衡与多种疾病的病理进程密切相关[3]。在正常人的大脑中,甲醛的浓度在0.2 ~ 0.4 mmol/L,体内适量的甲醛通过DNA去甲基化循环对于人的认知能力和记忆形成至关重要。甲醛浓度的升高会引起许多疾病如癌症、糖尿病、心脏、肝脏以及各种神经性病变,例如在患神经退行性疾病−阿尔茨海默症小鼠的脑组织中,甲醛浓度异常升高能够诱导τ蛋白过度磷酸化和β淀粉样蛋白错误折叠积聚,进而损伤神经网络,最终导致认知障碍和记忆力减退。因此,开发具有快速、灵敏、高选择性时空检测的甲醛探针对研究和阐明甲醛分子的生物学功能有重要的意义。

    荧光生物成像技术已经发展成为亚细胞水平分辨组织形态学的重要工具之一,特别是该技术以非侵入可视化方式结合显微成像技术实现了活细胞操控和活性物种的原位实时观测。分子荧光探针通常主要由荧光单元和识别单元组成,当识别基团与被分析物相互作用时,引起荧光基团化学环境发生变化并产生相应的信号变化,其中识别基团决定了探针分子的选择性和特异性,而荧光基团决定了识别的灵敏度。近年来,基于有机小分子的荧光探针对内源性甲醛的检测倍受关注[4],特别是反应型甲醛荧光探针已经被报道并被用于观察原位、实时、动态检测的活细胞中甲醛的水平变化。目前已报道的反应型甲醛荧光探针主要有NH2与甲醛反应,NHNH2与甲醛反应,Aza-Cope重排与甲醛反应和待测物再生型甲醛荧光探针等。本文介绍了这几种反应型甲醛小分子荧光探针进展,并对其设计思路进行简述。

    • 光诱导电子转移(Photoinduced Electron Transfer,PET)过程是设计荧光探针的主要策略之一,通常指电子供体或电子受体受光激发后,激发态的电子供体与电子受体之间发生电子转移的过程。探针分子中荧光基团与识别基团之间的PET过程使得荧光猝灭,但一旦识别基团与客体结合,PET过程将受到抑制,甚至被完全阻断,从而使荧光恢复。NH2取代基通常作为强的电子供体基团,能使荧光基团初始荧光淬灭,当NH2与甲醛的醛基之间发生亲核加成反应时形成C= N键(图1),伴随着供电子能力的强烈改变,荧光信号发生显著改变。

      图  1  NH2取代基与甲醛反应机理

      Figure 1.  Reaction mechanism of NH2 substituted group with formaldehyde

      Song等[5]以苯胺基团中NH2作为识别基团,氟硼吡咯(BODIPY)单元作为荧光团设计合成了探针1图2)。探针1中富电子的苯胺NH2取代基团与BODIPY荧光单元之间存在PET过程,使得探针1在其初始态表现为荧光猝灭。当在pH = 8的CH3OH溶液中加入甲醛时,探针1中的NH2与甲醛中的醛基反应形成C= N键,显著降低其供电子能力,有效抑制分子内的PET过程,进而生成强荧光的反应产物,表现为在535 nm处产生绿色强荧光发射。探针1是第一个可以在中性条件下检测甲醛的BODIPY荧光单元开-关型荧光探针,其对甲醛的检测限为165 nmol/L。

      图  2  探针1的分子结构及其对甲醛的检测机理[5]

      Figure 2.  Molecular structure of probe 1 and detection mechanism of formaldehyde [5]

      Cao等[6]以邻苯二胺的NH2取代基作为识别基团,构建了一种以BODIPY为荧光基团的高选择性甲醛荧光探针2图3)。当探针2与甲醛反应时,其荧光发射波长从525 nm红移至548 nm,并伴随着显著的荧光强度增加,特别是探针对甲醛表现出较低的检测限(104 nmol/L)。进一步的细胞荧光成像和检测试纸应用表明,在内源性细胞和气态环境中探针2对甲醛的检测表现得十分灵敏。该工作基于席夫碱反应和ICT(Intramolecular Charge Transfer)过程设计了一种具有水溶性、选择性强、检测限低的开-关型荧光分子探针,使其能够通过共聚焦荧光成像示踪活细胞中的外源性和内源性甲醛检测。

      图  3  探针2的分子结构及其对甲醛的检测机理[6]

      Figure 3.  Molecular structure of probe 2 and detection mechanism of formaldehyde [6]

      Lin等[7]以具有五元螺环结构的罗丹明6G为荧光团,并在螺环上引入NH2取代基团设计合成了能通过两步识别检测甲醛的探针3。如图4所示,探针分子内不仅有供电子的NH2取代基作为识别基团,而且其五元螺环结构的开-关性能亦由识别基团供电子能力决定。整个反应首先生成一个亚氨基的中间产物,接着开环生成一个带有咪唑的罗丹明衍生物,通过两步协同作用实现对甲醛的选择性识别。探针3含有一个封闭的五元环,表现出较弱的初始荧光,当NH2取代基与甲醛反应生成席夫碱C= N键时,能显著降低五元螺环叔氮原子上的电子云密度,使得其处于开环状态因而荧光显著增强,实现对甲醛分子的高选择性识别(图4)。在磷酸盐缓冲溶液(25 mmol/L,pH=7.4,w = 50%的二甲基亚砜)中,探针3与等物质的量的甲醛反应,其在560 nm处的荧光强度显著增强7.4倍,并伴随溶液颜色从无色变为粉色,检测限为7.7×10−7 nmol/L。该探针是首个实现对甲醛气体裸眼识别的荧光探针,而且可以用于HeLa活细胞中甲醛的成像研究,特别是其显著的颜色变化可用于食物中甲醛的识别,这表明探针3具有在生物系统、食品工业以及环境中检测甲醛的潜在应用。

      图  4  探针3的分子结构及其对甲醛的检测机理[7]

      Figure 4.  Molecular structure of probe 3 and detection mechanism of formaldehyde [7]

      Liu等[8]设计发展了一种以邻二氨基作为响应基团的罗丹明荧光分子探针4,基于探针分子与待测物之间的反应动力学以及反应产物的荧光特性差异,用于甲醛、甲基乙二醛(MGO)和草醛(OA)的鉴别和检测(图5)。探针4中NH2取代基与甲醛和甲二醛反应时,分别显示出荧光增强 (开)和荧光减弱 (关)的不同响应模式,并且可用于活细胞中甲醛和甲基乙二醛的成像。探针4在642 nm处呈现弱荧光发射,在加入甲醛后,其荧光发射波长蓝移至620 nm并且强度增强;与甲醛反应引起的荧光信号明显增强相比,MGO的加入导致探针4的初始荧光强度明显减弱。

      图  5  探针4的分子结构及其对甲醛的检测机理[8]

      Figure 5.  Molecular structure of probe 4 and detection mechanism of formaldehyde [8]

    • NHNH2取代基与甲醛反应机理如图6所示。

      图  6  NHNH2与甲醛反应机理

      Figure 6.  Reaction mechanism of NHNH2 and formaldehyde

      Song等[9]利用富电子的肼取代基团在8-氯代BODIPY染料上易发生亲核取代反应的特性,基于探针中的取代基与甲醛进行反应,设计发展了一种甲醛荧光探针5图7)。探针5与甲醛反应后,其分子内的TICT(Twisted Intramolecular Charge Transfer)过程减弱,形成蓝色荧光化合物,具有巨大的荧光开启强度,并且探针5对于甲醛具有较短的响应时间(<30 min)和较低的检测极限(0.18 μmol/L)。同其他活性羰基类物质相比,探针5对甲醛选择性高,并可以成功检测活细胞中甲醛的浓度变化。

      图  7  探针5的分子结构及其对甲醛的检测机理[9]

      Figure 7.  Molecular structure of probe 5 and detection mechanism of formaldehyde [9]

      Liu等[10]以1,8-萘酰亚胺为荧光团,研制了一种快速、简便、灵敏的甲醛衍生化分子探针6,在探针分子4位上引入存在PET过程的NH取代基团(图8),从而使探针初始态表现出较弱的荧光,当连接的NHNH2取代基与甲醛发生反应时,由于亚胺部分和氨基化合物形成推拉体系,同时叔胺基团的质子化也阻断了1,8-萘酰亚胺荧光的PET过程,因此在PET阻断过程中伴随产生强烈的ICT效应,最终产生强烈的荧光增强。在室温下加入甲醛后,探针6在9 min内呈现出明显的荧光增强,而且增强后的绿色荧光很容易被肉眼观察到。探针6对于甲醛具有良好的选择性,与H2S、CO、NO、苯等其他相关分析物相比,只有甲醛能引起明显的荧光增强。基于荧光探针6制备的荧光试纸,可定性检测甲醛。

      图  8  探针6的分子结构及其对甲醛的检测机理[10]

      Figure 8.  Molecular structure of probe 6 and detection mechanism of formaldehyde [10]

      Bi等[11]通过改变1,8-萘酰亚胺荧光团母体4位和1位上的取代基供电子能力,研究取代基的变化对探针分子光谱性能的影响。与探针6的结构和识别机理类似,探针7分子中NHNH2取代基与甲醛作用后(图9),亚胺的HOMO (Highest Occupied Molecular)能级低于萘酰亚胺的HOMO能级,阻断了其PET过程,表现出明显的开启型荧光信号。探针7对甲醛的灵敏度较高,检测限可低至20 nmol/L,并且具有快速响应能力(6 min)。此外,探针7可制备成甲醛检测试纸,为甲醛检测提供了一条方便、灵敏、快速的途径。探针7还可在活细胞中使甲醛成像,在绿色通道中有明显的荧光信号。因此,该荧光探针可能成为环境和生物系统中甲醛检测的一种有前途的工具。

      图  9  探针7的分子结构及其对甲醛的检测机理[11]

      Figure 9.  Molecular structure of probe 7 and detection mechanism of formaldehyde [11]

    • 氮杂的1,5-二烯类化合物在受热条件下发生[3,3]-σ迁移的反应称为Aza-Cope重排反应。图10所示为Aza-Cope重排反应机理,在重排之后连续进行Mannich反应,即利用Aza-Cope重排反应开发了一系列甲醛反应型荧光探针,目前多采用烯丙基胺基与甲醛发生[3,3]-σ重排反应以形成相应的醛基产物的策略。

      图  10  Aza-Cope重排反应机理

      Figure 10.  Aza-Cope rearrangement mechanism

      2015年,Chang课题组[12]设计出了一种以硅取代罗丹明染料的荧光团,首次报道了基于甲醛诱导Aza-Cope重排反应的开-关型荧光探针8,用于检测细胞内的甲醛。如图11所示,探针8的分子内有一个五元螺环,类似罗丹明表现出较弱的初始荧光,与甲醛发生Aza-Cope重排反应后,最终得到水解开环结构的目标产物,荧光显著增强,能够实现对甲醛分子的可视化识别检测。探针8对甲醛分子的检测表现出高选择性和高灵敏性,它不仅可以检测外源性甲醛,而且可以在乳腺癌细胞中可视化检测赖氨酸特异性去甲基化酶产生的内源性甲醛,在生物检测方面有重要和潜在的应用价值。探针8为生物体在遗传、衰老和疾病等生理过程中探测活性羰基化合物提供了一种研究手段。

      图  11  探针8的分子结构及其对甲醛的检测机理[12]

      Figure 11.  Molecular structure of probe 8 and detection mechanism of formaldehyde [12]

      Tang课题组[13]开发了一种酸性pH活化甲醛响应荧光探针9图12),能有效地去除在进入溶酶体之前细胞质和其他细胞器中的分析物干扰。探针9将1,8-萘酰亚胺荧光团连接到具有双光子特性的香豆素载体上,以4-(2-乙基)吗啉为溶酶体靶向定位基团,以侧链胺为测定基团。探针9在磷酸盐缓冲溶液(pH = 5.0)中,1,8-萘酰亚胺荧光团在566 nm处呈现弱荧光发射。当与甲醛反应后,探针9发生Aza-Cope重排反应,得到含香豆素荧光单元,并在荧光光谱506 nm处表现为明显的蓝移和强荧光增强。由于探针分子优先在溶酶体内积累,仅对溶酶体中的甲醛起作用,消除了细胞溶酶体以外其他细胞器中分析物的干扰,因此提高了检测的空间分辨率和准确性,为设计溶酶体靶向分子探针提供了一种新的思路。值得一提的是,基于双光子模式的探针9可以实现对生物细胞的甲醛实时成像。

      图  12  探针9的分子结构及其对甲醛的检测机理[13]

      Figure 12.  Molecular structure of probe 9 and detection mechanism of formaldehyde [13]

      Meng课题组[14]以6-取代喹啉骨架为荧光单元,设计了一种基于Aza-Cope重排与甲醛反应的双光子比率型荧光探针10图13)。探针与甲醛反应后,由于分子内ICT体系的拉电子能力显著增强,使得探针的荧光发射波长由405 nm处显著红移至490 nm处,两处的发射强度比(I490 nm / I405 nm)由0.34显著增加至7.52 (约增加22倍)。在生物相关的pH范围内,探针10的性能变化不敏感,并在720 nm处具有较大的双光子吸收截面(185 GM,1GM=1×10−50(cm4·s)/mol单位光子),其组织穿透深度为150 μm,并且具有较低的活细胞毒性。探针被成功用于检测活细胞和斑马鱼体内的内源性甲醛,验证了其生物学适用性。与之前报道的双光子甲醛荧光探针相比,探针10具有更大的双光子吸收截面、较高的荧光亮度以及更强的组织穿透深度。

      图  13  探针10的分子结构及其对甲醛的检测机理[14]

      Figure 13.  Molecular structure of probe 10 and detection mechanism of formaldehyde [14]

      Gao等[15]发展了一种新型的基于Aza-Cope重排反应并结合AIE (Aggregation Induced Emission)策略的荧光探针11用于检测甲醛,首次成功检测活细胞和临床肿瘤组织中的外源性和内源性甲醛(图14)。与甲醛反应后,Aza-Cope重排和水解使探针11具有AIE的特性,呈现出对甲醛高选择性和高灵敏度的荧光响应,并且拥有较低检出限(123 nmol/L)。此外,细胞低毒性的探针11还被成功用于活细胞中外源性和内源性甲醛的荧光生物成像,以及临床乳腺癌组织中甲醛的成像检测。因此,探针11在阐明甲醛在癌细胞中的生理作用方面具有重要意义,并可作为鉴别癌组织和正常组织的潜在工具。

      图  14  探针11的分子结构及其对甲醛的检测机理[15]

      Figure 14.  Molecular structure of probe 11 and detection mechanism of formaldehyde [15]

      Zhao等[16]研究开发了一种基于四苯乙烯的AIE荧光探针12图15),可通过荧光“开”“关”方便地检测气态甲醛。通过Aza-Cope重排与甲醛反应,在高效薄层色谱硅胶板上直接负载探针12,制备了便携式的甲醛固体传感器测试板,实现了对气态甲醛具有灵敏性、选择性和定量的检测。甲醛检测板的质量浓度检出限为0.036 mg/m3,低于世卫组织推荐的空气中甲醛质量浓度指导值(0.1 mg/m3)。检测结果明显,易于肉眼观察。甲醛的固体测试板作为一种基于AIE的气体甲醛固体传感器,与基于溶液的传感器相比,使用和运输更加安全、方便,对开发便携式气体甲醛传感器具有重要指导意义。

      图  15  探针12的分子结构及其对甲醛的检测机理[16]

      Figure 15.  Molecular structure of probe 12 and detection mechanism of formaldehyde[16]

    • 基于反应的荧光探针所面临的重要挑战是降低由于消耗分析物产生荧光信号而造成的原生分析物稳态的潜在扰动或局部浓度的变化。华东理工大学王卫课题组[17]以萘酰亚胺为发光单元,提出了甲醛再生荧光探针的新思路,设计合成了一种可再生的甲醛检测荧光探针13图16)。在分子探针的设计中,采用3-(苄胺)-丁二酰亚胺作为甲醛的选择性反应基团,实现了一种前所未有的区域特异性甲醛诱导的分子内反应策略。探针的作用原理如图16所示,探针13能够捕获分析物分子,诱导区域特异性亚胺键裂解,在释放捕获的甲醛分子同时,通过独特的双PET/ICT猝灭机制,荧光被开启。这些特性使其在生物系统中用于甲醛稳态和功能的研究时产生极小的干扰。探针13在细胞内和溶酶体内甲醛水平的检测、比较和成像中显示出应用潜力,因此,探针13独特的甲醛再生特性为生物系统中甲醛的稳态、信号传导和功能研究提供了重要的工具。

      图  16  探针13的分子结构及其检测机理[17]

      Figure 16.  Molecular structure of probe 13 and detection mechanism of formaldehyde [17]

    • 以反应类型为分类依据,对NH2、NHNH2与甲醛反应,Aza-Cope重排与甲醛反应以及基于待测物再生新型甲醛荧光探针进行了综述。这些荧光探针的荧光单元基团包含BODIPY、罗丹明、萘酰亚胺、香豆素、四苯乙烯等,其检测基于PET、ICT等机理产生荧光响应信号变化,并表现出较快的响应时间及较低的检测限度,而且有部分的探针成功应用于细胞、组织、斑马鱼中的甲醛检测,特别是王卫课题组提出的甲醛再生荧光探针的新思路,对于实时监测甲醛浓度变化,研究生物系统中甲醛的稳态、信号传导和功能提供了重要的可视化工具。

      迄今为止,甲醛的荧光探针在实际应用中仍受到诸多制约,例如在环境检测方面需要发展便携化的甲醛荧光探针试纸,并提高灵敏度。另一方面,如何发展长波长、高灵敏度、靶向性的甲醛荧光探针仍亟待研究。甲醛荧光探针的发展主要面临以下挑战:(1)近红外发射的荧光,母体较少且对其进行性能调控非常困难;(2) 选择性不高,亟待开发特异性识别甲醛的识别基团,以减少其他羰基化合物的干扰;(3) 灵敏度较低,受到反应动力学影响,如基于Aza-Cope重排机制不利于动态检测甲醛的分布;(4) 靶向性,具有细胞器定位功能的荧光探针极度缺乏,不利于在细胞器水平上研究甲醛的生理机制和代谢途径。深入开展与甲醛生物学功能密切相关的生物学研究,有助于更深入地认识相关疾病的生理和病理过程。

(17)  参考文献 (17) 相关文章 (17)

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