N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)（美国Sigma-Aldrich公司）；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、3-三乙氧基硅烷基-1-丙胺(APTES)（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三氯化铁、盐酸、正硅酸四乙酯、葡萄糖、无水乙醇、浓硫酸、浓磷酸、石墨粉、高锰酸钾和盐酸（国药集团化学试剂有限公司）；藤黄酸（GA）南京景竹生物科技有限公司）。

电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9123A）型，上海华连医疗器械有限公司；高压釜（RD-50型），北京实华科技发展公司；磁力搅拌仪（85-1型），上海司乐仪器有限公司；管式电阻炉（B13-3型），上海亚丰炉业有限公司；紫外-可见分光光度仪（UV-2450），日本Shimadzu公司；超声波振动棒（JM-1006），洁盟国际（香港）有限公司。

紫外-可见吸收光谱采用Shimadzu UV-2450型分光光度计测定；X射线粉末衍射(XRD)采用D/max 2550 VB/PC型X射线衍射仪（Cu靶Kα线，λ=0.154 06 nm）在室温下进行测定，管压40 kV，管流35 mA，衍射线束经石墨单色器过滤；透射电子显微镜(TEM)采用荷兰Philips公司Tecnai-12型(120 kV)，样品溶于乙醇超声分散后滴在铜网上，灯光照射晾干后测定；红外光谱采用Magna-IR 550型红外光谱仪测定；拉曼光谱图采用Reflex型的Renishaw拉曼光谱仪，通过414 nm和785 nm两个激光台进行测试；磁性能是通过VSM BHS-55型振动样品磁强计分析测定。

铁前驱体的制备：称取0.81 g FeCl₃·6H₂O溶于装有300 mL的去离子水的烧杯中，超声30 min后，滴加1 mL浓盐酸，混合溶液回流2 h后，旋转蒸发浓缩铁溶液至60 mL，此时溶液颜色为红色。

称取3 g水合葡萄糖，量取5 mL上述制备的铁前驱体和28 mL去离子水，超声混合形成均匀的溶液后，170 ℃水热反应12 h。冷却后，用无水乙醇洗涤3次，产物冷冻干燥48 h。

将0.1 g吸附有铁的碳球，超声分散于120 mL异丙醇水溶液中（异丙醇与水的体积比为5∶1），随后加入500 mg CTAB，磁力搅拌30 min，待形成均一溶液后加入1 mL浓氨水，30 min后，慢慢滴加1 mL正硅酸乙酯(TEOS)，30 ℃下搅拌反应12 h。反应完成后，产物分别用去离子水和无水乙醇交叉洗涤3次。产物于50 ℃下真空干燥6 h。将产物在550 ℃马弗炉中煅烧去除模板，在5% H₂/95% N₂（体积分数）氛围下350 ℃还原6 h，得到二氧化硅包覆的空心磁球，记为HMNPs。

将0.1 g上述制备的HMNPs分散于50 mL无水甲苯中，超声30 min，再加入1 mL APTES，125 ℃下回流12 h。分离后产物分别用去离子水和无水乙醇洗涤3次，50 ℃真空干燥8 h，得到氨基功能化的HMNPs。将20 mg EDC和16 mg NHS加入到50 mL 0.2 g/mL GO水溶液中，常温下搅拌反应2 h。然后将0.2 g HMNPs-NH₂加入到活化的氧化石墨烯溶液中，机械搅拌下反应2 h，磁分离，洗涤，真空干燥后获得产物HMNPs-GO。合成流程图如1所示。

图  1  HMNPs-GO合成路线

Figure 1.  Schematic diagram of the preparation of HMNPs-GO

分别取多份20 mg HMNPs-GO分散于30 mL磷酸缓冲溶液(pH=7.4)中，分别加入1、1.5、2.5、5、10 mg藤黄酸，利用超声波振动棒超声振荡30 min，避光下在恒温振荡仪中于37 ℃下以150 r/min速度振荡，在2、4、6、8、12、24 h后取出。磁分离，磷酸缓冲溶液洗涤，分别取1.0 mL的上清液和洗涤液，用紫外分光光度计测360 nm波长处的吸光度，根据式（1）计算载药率R_DL：

式中m₀为GA的总质量，m₁为上清液中GA的质量，m₂为洗涤液中GA的质量。

取10.0 mg负载了GA的HMNPs-GO粒子超声分散于不同pH（7.4和5.7）的0.1 mol/L磷酸缓冲溶液(PBS，30 mL)中，在恒温振荡仪中于37 ℃下以150 r/min速度振荡，每隔一段时间取出上清液，紫外分光光度计测量吸光度，然后补充等量的新鲜PBS缓冲溶液。可根据累积释药量计算得到药物缓释率（药物缓释率为累积释放量除以总药量）。其中累积释放量的公式如下：
　　　　M_n= c_nV₀+ (c₁+c₂+c₃+…+c_n ) V (2)
其中M_n为第n个取样点的累积释药量，C_n为第n个取样点的浓度，V₀为初始体积，V为每次取样的体积。

图2为合成的HMNPs的TEM图，从图中可以看出，这些球体具有良好的分散性，表面粗糙，且有一层黑色薄层物质吸附在球的内表面。球体的平均粒径在200~400 nm的范围内，二氧化硅壳的厚度约为20 nm。另外也可观察到，有一个直径约为60 nm的Fe₃O₄颗粒被包封在每个中空介孔二氧化硅球中。

图  2  HMNPs的TEM图

Figure 2.  TEM images of HMNPs

对合成的样品进行扫描电镜的表征，如图3所示。图3（a）为所合成的氧化石墨烯的扫描电镜图，从图中可以看到氧化石墨烯片层较薄，有很多褶皱。图3（b）是HMNPs的SEM图，与TEM结果（图2）相比，球的平均粒径为320 nm，分散性良好。图3（c）是氧化石墨烯修饰后的复合粒子SEM图，可以看到氧化石墨烯表面有很多球体覆盖，表明石墨烯成功和HMNPs纳米粒子复合。图3（d）为HMNPs-GO高倍扫描分析，由图可以看到，SiO₂球表面有一些薄而透明的物质接枝，表明GO成功修饰到空心球的表面。

图  3  GO (a), HMNPs (b), HMNPs-GO (c～d)的SEM图

Figure 3.  SEM images of GO (a), HMNPs (b), HMNPs-GO (c～d)

通过XRD对合成的GO，mSiO₂和HMNPs-GO纳米复合材料的晶体结构进行了研究（图4（a））。图4（a）中在2θ=10.5°观察到GO的特征衍射峰，表明合成的是氧化石墨烯；在2θ=22.7°处宽的衍射峰为SiO₂的特征衍射峰。在HMNPs-GO图谱中2θ为30.2°，35.5°，43.2°，53.8°，57.3°和62.9°处，均具有与纯纳米Fe₃O₄颗粒相吻合的特征峰，分别对应反尖晶石型面心立方相Fe₃O₄的(220)，(311)，(400)，(422)，(511)和(440)晶面，说明HMNPs的衍射峰位置与纯Fe₃O₄卡片(JSPDS 19-0629)相同^[14]，证实了所合成的样品内核为Fe₃O₄。磁性纳米空心球在2θ=22.7°处，出现宽的衍射峰，为非晶型纳米SiO₂的特征衍射峰，说明SiO₂已成功地包覆于模板表面。但是从HMNPs-GO的XRD图中没有观察到GO的特征衍射峰，这归因于HMNPs纳米粒子的引入以及酰胺键破坏了石墨烯片的有序堆积，导致衍射峰消失。通过以上的XRD分析结果，进一步表明成功地制备了HMNPs-GO复合物。

图  4  (a) GO, mSiO₂和HMNPs-GO的XRD; (b) GO, Fe₃O₄, HMNPs和HMNPs-GO的红外谱图

Figure 4.  (a) XRD patterns of GO, mSiO₂ and HMNPs-GO; (b) FT-IR spectra of GO, Fe₃O₄, HMNPs and HMNPs-GO

图4（b）是GO, Fe₃O₄, HMNPs和HMNPs-GO的红外光谱谱图。在GO的光谱中，1 714 cm⁻¹处的峰是C＝O伸缩振动引起的。在Fe₃O₄光谱中，578 cm⁻¹处出现的强振动吸收峰是Fe−O键的特征吸收峰，在HMNPs的红外光谱中，586 cm⁻¹处的吸收峰是Fe−O键的伸缩振动峰，在806, 468 cm⁻¹处的峰归属于Si−O−Si和O−Si−O的伸缩振动频带，可以说明成功获得HMNPs。在HMNPs-GO的光谱中，1 126 cm⁻¹的吸收峰是C−N键的伸缩振动峰。当发生酰胺发应时，C＝O键的吸收峰从1 714 cm⁻¹转移到了1 767 cm⁻¹，证实了GO和HMNPs发生了酰胺反应。

拉曼光谱是表征石墨材料的常用分析手段。由于石墨烯π电子所固有的离域性，这种碳材料的拉曼光谱都是共振的，所以拉曼光谱可以有效地表征样品的振动特性和电子性质。对于所有基于碳的纳米材料（如富勒烯，石墨或者共轭聚合物），拉曼光谱只在1 000~2 000 cm⁻¹光谱区域内包含几个重要的峰。氧化石墨烯最突出的拉曼特性就是D峰和G峰，G峰源于碳链和环中sp²原子对的拉伸振动，而D峰则源于环中sp²原子的呼吸振动。D峰对应的振动通常是禁阻的，但无序性比如缺陷的出现破坏了其对称性从而使得该振动被允许，另外拉曼光谱中较高的D峰和G峰的强度比值(I_D/I_G) 揭示了石墨化结构中的更多缺陷和无序^[15]。图5分别显示了GO，HMNPs-GO的拉曼光谱。GO的拉曼光谱在1 352和1 599 cm⁻¹处显示典型的D峰和G峰。HMNPs-GO复合物的光谱在1 356和1 606 cm⁻¹处显示出两个强的尖锐峰，这归因于GO的D峰和G峰，表明复合物体系中存在GO片。此外，与GO的I_D/I_G(0.848)相比，HMNPs-GO的I_D/I_G(0.872)出现小的增加，表明HMNPs引起碳sp²平面域的缺陷和sp²结构域的紊乱。由于酰胺键和HMNPs与GO之间的相互作用，说明GO已经成功修饰到纳米颗粒表面，使HMNPs-GO结构的有序性降低。

图  5  HMNPs-GO和GO的拉曼谱图

Figure 5.  Raman spectra of HMNPs-GO and GO

HMNPs响铃状磁性空心球的的氮气吸附-脱附等温线及其通过BJH方法计算得到的相对应的孔径分布曲线如图6所示。由图6（a）可见，所合成的响铃状HMNPs属于IUPAC分类中的IV型。在较低的相对压力下，吸附量迅速上升，曲线上凸，说明吸附质与材料表面存在较强的相互作用。由孔径分布图（图6（b））可以看出其最可几分布为2.19 nm，且孔径分布均匀。通过BET (Brunauer-Emmett-Teller) 计算，样品的比表面积为1 398.055 m²/g，孔体积为0.803 3 cm³/g，说明响铃状磁性空心球具有较大的内腔。

图  6  HMNPs的N₂吸附脱附曲线与孔径分布图

Figure 6.  N₂ adsorption-desorption isotherm and pore size distribution of HMNPs

在室温下通过VSM测试HMNPs和HMNPs-GO磁性能结果见图7。由图7可知在室温下HMNPs饱和磁化强度为7.44 emu/g，HMNPs-GO饱和磁化强度为6.38 emu/g。两者的磁性均小于纯Fe₃O₄的磁性，这可能与空心球的结构和非磁性材料二氧化硅和氧化石墨烯有关。复合粒子虽然含铁量不高，但是却有很大的空腔用于载药。

图  7  HMNPs和HMNPs-GO的磁滞回线

Figure 7.  Magnetization hysteresis curves of HMNPs and H HMNPs-GO

在37 ℃，pH=7.4时，HMNPs-GO负载不同质量GA24 h后的载药性能如表1所示。从表中可以计算得出随着GA质量的增加，HMNPs-GO的载药量也在不断的增加，但负载率却在不断的下降，主要是因为当GA质量增加时，氧化石墨烯表面的负载率逐渐达到饱和，并且空心球外部被大量的GA占有，使其他的GA不能再进入空腔，使其不能增加负载量。由表可知，20 mg的HMNPs-GO对相同质量的GA的载药量比HMNPs的载药量高，主要是因为GO较大的比表面积增加了对药物的负载。m（GA）=2.5 mg时HMNPs-GO的有效载药量为89.82 mg/g，较本课题组之前所报道^[16]的，在相同条件下，氧化石墨烯功能化磁性纳米颗粒的载药量（49.79 mg/g）高，原因是HMNPs相对于磁性纳米颗粒而言具有较大的表面积以及较大的空腔，药物不仅可以负载在空心球外部也可渗透进入空腔里面以增加其负载量。

图8示出了HMNPs-GO对GA的吸附等温线。从图8可以看出HMNPs-GO对GA的吸附等温线属于II型，随着GA的质量浓度增大，纳米粒子对药物的吸附量不断增大。吸附等温线呈现向上凸的现象，表明吸附剂HMNPs-GO对吸附质GA具有较强的吸附作用^[17]，归结于GA与HMNPs-GO存在较强的π-π堆积作用。

图  8  HMNPs-GO对GA的吸附等温线

Figure 8.  Adsorption isotherm of GA on HMNPs-GO

吸附过程可以分为两个阶段。当平衡质量浓度为0~23.33 μg/mL时为第一阶段，在此阶段中达到单分子层的饱和吸附，主要为药物在纳米粒子表面的负载过程；平衡质量浓度为23.33~164.0 μg/mL时为第二阶段，此过程起初进行得比较缓慢，可能是药物在HMNPs-GO表面完全负载之后，存在两种途径，其一为一部分GA进入HMNPs-GO空腔内部，空出的位置由外部环境中的药物不断地占有，使吸附量增加，其二为GA与氧化石墨烯的π-π堆积作用，使药物不断在氧化石墨烯上负载，增加负载量。

吸附负载数据采用双吸附等温线法^[18]来拟合，即采用Langmuir-Freundlich等温线公式。Langmuir表达式为：

Freundlich等温线模型描述了多相表面平衡，其表达式为：

其中，C_e是平衡质量浓度(μg/mL)，Q_e是平衡时的吸附负载量(mg/g)，Q_m是单层饱和吸附量（mg/g），k_l是Langmuir平衡常数，k_f是Freundlich平衡常数。

图9所示为HMNPs-GO对GA的Langmuir和Freundlich等温吸附负载线性拟合。从图9（a）可看出在Langmuir吸附等温的线性拟合中1/Q_m为0.006 2，1/(Q_mk_l)为0.116 8，且相关系数R²=0.980 0。图9（b）对Freundlich吸附等温线性拟合得出1/n为0.248 0，相关系数R²=0.987 8。通过对比两者的相关系数，得出HMNPs-GO对药物的吸附比较符合Freundlich等温式，其1/n仅为0.248 0。根据我们以往的研究^[19]，1/n越小，吸附剂的吸附性能和吸附量越大，证明HMNPs-GO对药物GA具有较好的吸附性能。

图  9  HMNPs-GO对GA的Langmuir (a)和Freundlich (b)等温吸附负载线性拟合

Figure 9.  Langmuir isotherm model (a) and Freundlich isotherm model (b) for adsorption or loading of GA on HMNPs-GO

HMNPs-GO对GA的载药性能如图10（a）所示，在37 ℃，pH=7.4时不同时间段20 mg HMNPs-GO负载2.5 mgGA，在24 h后达到最大负载率为71.85%。负载GA的HMNPs-GO（HMNPs-GO-GA）在PBS (pH=7.4, pH=5.7)中、37 ℃下的缓释曲线如图10（b）所示。很明显，HMNPs-GO-GA的缓释对pH具有依赖性。在1.5 h之前，两种pH条件下的缓释率基本接近，但2 h之后，在pH=5.7的缓释率开始高于pH=7.4的缓释率，而且两者的差距随着时间推移逐渐增大。在30 h时，pH=7.4的缓释率基本达到平衡状态，保持在33.5%左右；而pH=5.7的缓释率在67.5%，仍然呈持续上升状态，至70 h时，缓释率达到平衡，保持在82.0%。

图  10  (a) HMNPs-GO对GA在pH=7.4时的负载率和(b) HMNPs-GO-GA对GA在pH=5.7和7.4时的缓释率

Figure 10.  (a) GA loading efficiency of HMNPs-GO at pH=7.4; (b) GA accumulated release of HMNPs-GO-GA at pH=5.7 and 7.4

酸性条件下，纳米粒子具有很好的缓释效果，主要是由于GA分子上同时含有羟基和羧基，在酸性条件下，羟基会与氢离子结合为−OH₂⁺，使GA带有正电荷^[16]；而纳米粒子表面被氨基功能化形成亚胺，在酸性条件下，亚胺带有正电荷，使整个纳米粒子带有正电荷。因此当pH降低时，药物分子与纳米粒子都带有正电荷，两者相互排斥使药物分子释放出来。通过以上模拟体内的缓释实验，体内GA在血液中(pH=7.4)保持负载于HMNPs-GO表面，但是当进入酸性较强的肿瘤微环境时，药物将被释放。因此GA的释放具有pH敏感性，这样不仅有利于癌症的治疗，也可减少药物对正常组织的毒副作用。

从图10（b）可以看出，药物的释放扩散具有两个阶段，初始阶段是高释放，随后是低剂量的药物缓慢释放出来。初始时的释放是由于纳米材料外表面GA的扩散作用，后一阶段的释放是药物分子从空心球内部经介孔进到外部环境的缓慢扩散作用。由于孔径之间存在阻力以及空心球内部与外部环境的压力差导致药物较为缓慢的扩散，最终达到平衡。药物的释放主要是由速控步来决定的，Bhaskar等^[20]对药物分子的扩散释放是否具有速控步建立了相关的模型，如式（4）所示。

式中x_t为缓释率，d_p为粒径，D为扩散系数，t为时间。作ln(1−x_t)与t^0.65的关系图（见图11），从图11可以看出，在pH=5.7时，ln(1−x_t)与t^0.65呈直线关系(R²=0.982 8)，而在pH=7.4时，ln(1−x_t)与t^0.65呈抛物线关系。出现这两种不同现象可能是由于在不同的酸性条件下药物分子的扩散机理不同。在酸性条件下，吸附在空心球外部的药物分子先扩散出来，而内部的药物分子会由于空心球与它本身都带有相同的电荷，两者相互排斥而扩散出来，因此ln(1−x_t)与t^0.65呈直线关系。在中性条件下，负载于HMNPs-GO表面的药物会迅速释放，而负载于HMNPs-GO空腔内的药物会稳定存在，只能通过自身缓慢地扩散出来，因此ln(1−x_t)与t^0.65呈现先快速增加，后增加缓慢的趋势。其扩散机理再一次证明了HMNPs-GO对药物的缓释具有pH敏感性，并且在中性条件下对药物的损失不是很大，可以通过调节pH来释放药物。

图  11  在pH=5.7 (a)和pH=7.4 (b)时，GA从HMNPs-GO中缓释率与t^0.65的相关函数

Figure 11.  Release rate of GA from HMNPs-GO vs. t^0.65 at pH=5.7 (a) and pH=7.4 (b)

为了进一步探究缓释过程的机理，通常用准一级动力学方程或准二级动力学方程来描述药物在载体上的缓释动力学机理。准一级动力学拟合方程为：ln(Q_e−Q_t) = ln Q_e−k₁t, 式中Q_e为载体对药物的平衡缓释量(mg/g)；Q_t为t时刻载体对药物的缓释量(mg/g)；k₁为准一级动力学常数(g/(mg_`h))。对ln(Q_e−Q_t)和时间t进行线性拟合（见图12）得出动力学常数k₁。由图12（a）可知在pH=5.7时，相关拟合系数R²=0.957 9，pH=7.4时，相关拟合系数R²=0.968 6。

图  12  不同pH环境下的HMNPs-GO准一级和准二级动力学曲线

Figure 12.  First-order reaction and Second-order reaction kinetics for the release of GA in HMNPs-GO at different pH.

准二级动力学拟合方程为：t/Q_t = 1/(k₂Q_e²) + t/Q_e, 式中k₂为准二级动力学常数(g/(mg_`h))。采用该方程对t/Q_t和时间t进行线性拟合，由拟合直线可算出平衡缓释率Q_e以及动力学常数k₂。如图12（b）所示，pH=5.7时其相关拟合系数R²为0.998 1，pH=7.4时其相关拟合系数R²为0.999 3，相较于准一级动力学模型，载体在不同pH值下的缓释更适合于准二级动力学模型。另外根据准二级方程可以得到初始反应速率v₀ (mg/(g·h))，方程式为：v₀=k₂Q_e²。

对HMNPs-GO载体在pH=5.7和pH=7.4时的缓释量进行拟合，由图12（b）的拟合结果计算得，平衡缓释量分别为162.866 4和67.249 5 mg/g，略大于实验80 h后的平衡缓释量（147.147、64.514 mg/g)），随着缓释时间的延长，还会有少量的GA从载体上释放出来。经计算pH=5.7时，初始缓释速率为17.727 mg/(g·h)大于pH=7.4时的缓释速率（15.370 mg/(g·h)），这与实际上也比较吻合。准二级方程拟合结果如表2所示。

对比以上分析，酸性条件下的缓释量和初始缓释速率均高于中性条件下的缓释量和初始缓释速率，从理论上又一次验证了HMNPs-GO载体缓释GA具有明显的pH依赖性，更利于载体在药物缓释方面的应用。

本文采用双模板法控制HMNPs的介孔核-壳结构，并通过蚀刻法，制备了比表面积高达1 398.05 m²/g、孔体积为0.803 3 cm³/g及最可几分布为2.19 nm的HMNPs。基于EDC/NHS的交联，制备了最可几分布为GO功能化HMNPs（HMNPs-GO）。通过结构分析，并比较GO和HMNPs-GO在拉曼光谱的D峰和G 峰强度比值，证实GO已经成功修饰到磁性纳米空心球表面。本文研究了HMNPs-GO对GA的负载与缓释性能，研究结果表明HMNPs相对于一般的磁性材料对GA有较高的吸附负载率，HMNPs-GO对GA的吸附等温线属于II型，归结于GA与HMNPs-GO存在较强的π-π堆积作用。HMNPs-GO-GA对GA的释放有pH依赖性，在酸性条件下HMNPs-GO-GA对GA的缓释率较高且对药物的释放主要是由于相同电荷之间的排斥而扩散出来。此外，对GA释放的动力学研究表明，HMNPs-GO-GA在不同pH下的药物释放都适合准二级动力学方程，与中性条件相对比，在酸性条件下的释放量和缓释速率都相对比较高。因此可利用复合材料对pH的敏感这一特性，在不同酸性条件下控制其释放量，减少其在不同组织的毒副作用。