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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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Kap147/Kpn杂合启动子引导Cre重组酶在转基因小鼠睾丸组织中特异性表达

    作者简介: 刘 飞(1989-),男,山西吕梁人,硕士生,研究方向为基因表达和调控。E-mail:feilenw@126.com;
    通讯作者: 范立强, fanglq@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: Q291

A Testis-Specific Expression Cre Recombinase in Transgenic Micel by Kap147/Kpn Hybrid Promoter

    Corresponding author: Liqiang FAN, fanglq@ecust.edu.cn
  • CLC number: Q291

  • 摘要: 为了验证杂合启动子Kap147/Kpn的体内、外功能,构建了Kap147/Kpn引导的Cre重组酶转基因鼠。体外细胞转染和激素诱导证实Kap147/Kpn启动子具有细胞特异性,且受雄激素诱导。通过RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)和荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction)证实Kap147/Kpn启动子引导Cre重组酶在转基因鼠(Cre-F0-2)睾丸组织中特异表达。荧光定量PCR检测发现,Cre mRNA在转基因鼠睾丸中的表达量与小鼠年龄相关,经15 mg/(kg·d)二氢睾酮(DHT)处理后睾丸中Cre mRNA表达量增加1.7倍,经100 mg/(kg·d)醋酸环丙孕酮(CAP)处理后Cre mRNA表达量降低约50%,证实Kap147/Kpn启动子在转基因鼠体内受雄激素调控。荧光组化显示,转基因鼠Cre-F0-2与双荧光Cre重组酶报告鼠杂交后,能成功介导子代鼠睾丸组织特异性的基因敲除。杂合启动子Kap147/Kpn引导的Cre重组酶转基因鼠(Cre-F0-2)具有雄激素调节性和睾丸靶向性,是一个潜在的研究睾丸基因功能的有力工具。
  • 图 1  基因结构和基因重组原理示意图

    Figure 1.  Scheme of structure and recombination of gene

    图 2  不同Kap启动子片段引导Cre重组酶在OK细胞中的表达活性和雄激素诱导性分析

    Figure 2.  Androgen-regulated Cre recombinase expression driven by Kap promoter and Kap/Kpn hybrid promoter in OK cells

    图 3  Kap147/Kpn启动子引导Cre重组酶的细胞特异性表达    

    Figure 3.  Cell-specific Cre recombinase expression driven by Kap147/Kpn hybrid promoter in cultured cells

    图 4  Cre基因和Kap基因在Cre-F0-2转基因小鼠不同组织中的表达

    Figure 4.  Transgenic Cre and endogenerous Kap gene expression in the offspring of transgene mice Cre-F0-2

    图 5  Cre基因在睾丸组织中的表达受雄激素的调控

    Figure 5.  Androgen regulated expression of Cre gene in the testis

    图 6  Cre重组酶在双荧光报告鼠体内介导基因重组

    Figure 6.  Gene recombination mediated by cre recombinase in Kap147/Kpn-Cre/mT-mG double transgenic mice

    表 1  RT-PCR引物序列

    Table 1.  Primer sequence of RT-PCR

    PrimersSequence
    Actin-F5’-CCATCTCCTGCTCGAAGTCT-3’
    Actin-R5’-CCATCTACGAGGGCTATGCT-3’
    Cre-F5’-TGTTTCACTGGTTATGCGGC-3’
    Cre-R5’-AGTCATCCTTAGCGCCGTAA-3’
    Kap-F5’-ACTGTGGCTTTCCCCCTGTC-3’
    Kap-R5’-CTTCCTCGTTCTTTCTTCTTTG-3’
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-08-30
  • 网络出版日期:  2019-10-09

Kap147/Kpn杂合启动子引导Cre重组酶在转基因小鼠睾丸组织中特异性表达

    作者简介:刘 飞(1989-),男,山西吕梁人,硕士生,研究方向为基因表达和调控。E-mail:feilenw@126.com
    通讯作者: 范立强, fanglq@ecust.edu.cn
  • 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237

摘要: 为了验证杂合启动子Kap147/Kpn的体内、外功能,构建了Kap147/Kpn引导的Cre重组酶转基因鼠。体外细胞转染和激素诱导证实Kap147/Kpn启动子具有细胞特异性,且受雄激素诱导。通过RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)和荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction)证实Kap147/Kpn启动子引导Cre重组酶在转基因鼠(Cre-F0-2)睾丸组织中特异表达。荧光定量PCR检测发现,Cre mRNA在转基因鼠睾丸中的表达量与小鼠年龄相关,经15 mg/(kg·d)二氢睾酮(DHT)处理后睾丸中Cre mRNA表达量增加1.7倍,经100 mg/(kg·d)醋酸环丙孕酮(CAP)处理后Cre mRNA表达量降低约50%,证实Kap147/Kpn启动子在转基因鼠体内受雄激素调控。荧光组化显示,转基因鼠Cre-F0-2与双荧光Cre重组酶报告鼠杂交后,能成功介导子代鼠睾丸组织特异性的基因敲除。杂合启动子Kap147/Kpn引导的Cre重组酶转基因鼠(Cre-F0-2)具有雄激素调节性和睾丸靶向性,是一个潜在的研究睾丸基因功能的有力工具。

English Abstract

  • 基因打靶技术的进步为基因序列的编辑和基因功能研究提供了有力的工具,但是传统的基因打靶存在许多限制,比如胚胎或产后致死,多组织表达导致基因功能研究不明确。为了突破这种限制,以Cre/loxP系统为代表的条件性基因打靶技术使基因功能的研究得以在特定的组织细胞、特定的发育时间内精确进行。Cre/loxP系统利用组织特异性启动子或诱导性启动子引导Cre重组酶在特定条件下表达,介导由loxP位点锚定的基因序列切除、插入或倒置。为了促进Cre/loxP系统在基因功能研究中的应用,大量的组织特异性、诱导性Cre转基因鼠需要被建立。

    肾脏雄激素调控蛋白(Kidney androgen-regulated protein,Kap)是一种在小鼠肾脏组织中大量表达的蛋白质[1],其表达量约占肾脏总mRNA的4%[2]。研究发现Kap基因的mRNA主要在小鼠肾小管上皮细胞中表达,并且其基因表达受到多种激素如雄激素、甲状腺激素、雌激素等的调控,其中受雄激素的诱导尤为显著[3]。除了肾脏之外,Kap基因的表达只在睾丸、附睾、怀孕雌鼠的子宫以及一些生殖器官中被少量地检测到[4-5]

    基于Kap基因良好的组织特异性和激素诱导性,Kap启动子被广泛应用于转基因研究。Ding等[5-6]利用1.5 kb的Kap启动子与人血管紧张素原(Human Angiotensinogen,HAGT)的基因融合制备了转基因鼠,研究结果表明1.5 kb的Kap启动子可以成功引导外源基因HAGT在肾脏组织中的特异性表达,并且可被雄激素诱导。鉴于仅1.5 kb的Kap启动子自身难于引导除HAGT以外的其他外源基因的表达,研究人员保留Kap-HAGT结构中的大部分区域,构建突变体Kap2,并成功引导了PPARα[7]p21WAF1DN-Cdk2[8]等多种外源基因在肾脏的雄激素调控性表达。

    本课题组前期研究中对1 542 bp的Kap启动子进行截断分析,鉴定了一个147 bp的最小启动子(Kap147)[9]。在不改变细胞特异性的基础上,Kap 147启动子具有比1 542 bp Kap启动子更强的活性和雄激素敏感性。在HAGT基因内含子中发现了一个1.4 kb的增强子序列(Kpn)[10],该增强子可以使1 542 bp Kap启动子的活性增强1.5~2倍。本文将Kap147启动子与1.4 kb Kpn增强子融合构建Kap147/Kpn杂合启动子,在体外细胞水平上验证其细胞特异性和受雄激素调控性,并且利用Kap147/Kpn杂合启动子引导Cre重组酶构建了转基因鼠,在活体水平上评价其用于基因打靶的可行性。

    • 质粒pGL3-Kap147-Luc、pGL3-Kap1542-Luc、pGL3-Kap1542/Kpn-Luc和pGL3-Basic均为本实验室之前构建、保存[9-10]。用限制性内切酶Kpn I单酶切质粒pGL3-Kap1542/Kpn-Luc凝胶纯化获得1.4 kb的HAGT Kpn片段,然后将其嵌入到pGL3-Kap147-Luc质粒的Kpn I酶切位点中,构建成为pGL3-Kap147/Kpn-Luc。用限制性内切酶Hind III和Xba I双酶切α1-Cre质粒(由Dr. Camper SA馈赠)获得2 kb的Cre重组酶编码片段,同时利用Hind III和Xba I分别双酶切质粒pGL3-Basic、pGL3-Kap147-Luc、pGL3-Kap147/Kpn-Luc和pGL3-Kap1542/Kpn-Luc,将质粒中的Luc基因替换为Cre基因,构建重组质粒pGL3-Cre、pGL3-Kap147-Cre、pGL3-Kap147/Kpn-Cre和pGL3-Kap1542/Kpn-Cre。

    • OK、LLC-MK2、COS-7和A549细胞购自中国科学院上海生命科学研究院。所有细胞均培养在含体积分数10%的胎牛血清中、L-谷氨酰胺和双抗(青霉素/链霉素)的DMEM(Dulbecco's Modified)培养基中。细胞转染步骤按照梭华-Sofast®转染试剂说明书进行。

      细胞荧光实验中,将OK、LLC-MK2、COS-7和A549细胞按每孔5×105个培养在六孔板中,Cre重组酶检测质粒pCMV-EGFP-stop-RFP和pGL3-Kap147/Kpn-Cre按照物质的量之比1∶1混合,分别转染到4种细胞中,对照组仅转染等物质的量的pCMV-EGFP-stop-RFP质粒。然后继续培养36 h,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞,激光条件下用荧光显微镜在488 nm处观察绿色荧光蛋白表达情况,在568 nm处观察红色荧光蛋白表达情况。

      雄激素应答实验中,分别向OK细胞共转染25 ng pCMV-stop-Luc与等量的pGL3-Basic、pGL3-Cre、pGL3-Kap1542/Kpn-Cre、pGL3-Kap147-Cre或pGL3-Kap147/Kpn-Cre质粒,同时转染25 ng pSG5hAR质粒作为雄激素受体来源、5 ng phRL-TK质粒作为内参。转染24 h后,更换含有15 nmol/L二氢睾酮(DHT)或无二氢睾酮的新鲜培养基,继续培养24~48 h,利用双报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。具体实验方法同前期研究[11]描述。

    • pGL3-Kap147/Kpn-Cre质粒经Not I单酶切线性化,凝胶电泳纯化、回收5.6 kb目标片段,将目标基因原核显微注射入FVB/N小鼠受精卵中,经筛选培育获得Kap147/Kpn-Cre转基因首建鼠。转基因子代鼠通过PCR进行遗传分析,提取小鼠尾尖组织基因组,根据Cre重组酶基因序列设计上、下游引物(F: 5’-TGTTTCACTGGTTATGCGGC-3’, R: 5’-AGTCATCCTTAGCGCCGTAA-3’),扩增500 bp左右Cre基因片段。小鼠饲养于上海交通大学清洁动物房中,给予12 h昼夜交替照明,以SPF级清洁鼠粮和无菌饮用水喂养。

    • 转基因小鼠经颈椎脱臼法处死后,解剖、分离各器官,利用RNAiso Plus试剂(购自Takara公司)抽提组织中的RNA。为了避免残留基因组对RT-PCR检测的干扰,RNA样品提取后用DNase I(购自Thermo公司)在37 ℃消化1 h,以去除基因组后的RNA为模板,用oligo dT引物和PrimeScript RT反转录试剂盒(购自Takara公司)将抽提得到的mRNA反转录为cDNA,用于RT-PCR的检测。

      小鼠不同组织的cDNA样品进行PCR和琼脂糖凝胶电泳分析,β-Actin基因作为内参。同时加入Kap基因检测,比较外源Cre基因与内源Kap基因的表达差异。引物序列见表1

      PrimersSequence
      Actin-F5’-CCATCTCCTGCTCGAAGTCT-3’
      Actin-R5’-CCATCTACGAGGGCTATGCT-3’
      Cre-F5’-TGTTTCACTGGTTATGCGGC-3’
      Cre-R5’-AGTCATCCTTAGCGCCGTAA-3’
      Kap-F5’-ACTGTGGCTTTCCCCCTGTC-3’
      Kap-R5’-CTTCCTCGTTCTTTCTTCTTTG-3’

      表 1  RT-PCR引物序列

      Table 1.  Primer sequence of RT-PCR

      为了更加准确地分析Cre基因和Kap基因的表达情况,进一步利用SYBR Green® PCR Mastermix(购自东洋纺生物科技有限公司)和CFX96荧光定量分析系统(Bio-Rad公司)对Cre基因和Kap基因的mRNA水平进行定量检测。荧光定量PCR反应条件按照试剂盒推荐设置,每个样品设置3个平行,收集SYBR Green下的荧光数据,用2−△△CT法进行数据分析。

    • 分别选取出生约4 d、45 d、105 d,180 d和390 d的雄性转基因鼠,模拟小鼠幼年、青少年、成年、老年不同发育时期。每个年龄段3只,解剖其睾丸组织,采用RT-PCR和荧光定量PCR分析Cre基因的表达情况。

      选取9只12~14周龄的健康转基因雄性小鼠,随机分为3组,每组3只,诱导组每日通过颈背部注射15 mg/(kg·d) DHT,抑制组每日注射100 mg/(kg·d)醋酸环丙孕酮(CAP),对照组注射体和等体积的二甲基亚砜(DMSO,100%),连续处理10 d后,解剖小鼠睾丸组织,荧光定量PCR分析Cre基因表达情况。

    • 双荧光Cre重组酶报告鼠(B6.129 (Cg)-Gt (ROSA) 26Sor,购自南京生物医药研究院)在自然条件下,全身表达膜定位的是红色荧光蛋白,而在Cre重组酶介导的基因敲除后,表达膜定位的是绿色荧光蛋白[12]。将双荧光Cre重组酶报告鼠与Kap147/Kpn-Cre转基因小鼠杂交,在其子代鼠中通过PCR分析筛选6~12周的双阳转基因小鼠。颈椎脱臼法处死小鼠,分离心、肝、肾、睾丸和卵巢组织,用OTC(Optimal Cutting Temperature Compound)包埋后切成10 μm厚的冰冻切片,将切片浸入PBS中10 min后洗去残留的OTC溶剂,滴加适量的无荧光封固剂,用荧光显微镜进行观察、拍照。

    • 为了分析Kap147/Kpn杂合启动子在细胞中的活性,将HAGT Kpn片段插入到pGL3-Kap147-Luc质粒的Kpn I位点,构建了pGL3-Kap147/Kpn-Luc然后又通过Xba I 和 Hind III双酶切将Luc基因替换为Cre基因,构建了pGL3-Kap147/Kpn-Cre。Kap147/Kpn杂合启动子引导Luc基因的结构见图1(a)Kap147/Kpn杂合启动子引导Cre基因的结构见图1(b)。Cre重组酶介导Luc基因和RFP基因表达的原理示意图分别见图1(c)图1(d)

      图  1  基因结构和基因重组原理示意图

      Figure 1.  Scheme of structure and recombination of gene

      pGL3-Basic、pGL3-Cre、pGL3-Kap1542/Kpn-Cre、pGL3-Kap147-Cre和pGL3-Kap147/Kpn-Cre分别与pCMV-stop-Luc质粒共转染OK细胞48 h后,Luc荧光素酶的表达情况见图2。结果显示pGL3-Cre质粒中Cre重组酶使pCMV-stop-Luc中Luc荧光素酶的活性增加了7.2倍,并且受到雄激素的诱导(Luc荧光素酶活性为非诱导组的1.2倍)。pGL3-Kap147-Cre、pGL3-Kap147/Kpn-Cre和pGL3-Kap1542/Kpn-Cre中Cre重组酶的基础表达量分别是pGL3-Cre表达量的4.1、7.8和7.0倍,在15 nmol/L的雄激素诱导后,表达量分别上升6.8、7.7和3.8倍。在Kap147,Kap147/Kpn和Kap1542/Kpn 3个启动子中,Kap147/Kpn启动子的活性和对雄激素的敏感性都是最强的。

      图  2  不同Kap启动子片段引导Cre重组酶在OK细胞中的表达活性和雄激素诱导性分析

      Figure 2.  Androgen-regulated Cre recombinase expression driven by Kap promoter and Kap/Kpn hybrid promoter in OK cells

      pCMV-EGFP-stop-RFP质粒在无Cre重组酶的情况下表达绿色荧光蛋白,当存在Cre重组酶时,通过切除loxP片段锚定的EGFP基因,表达红色荧光蛋白,基因重组原理示意图见图1(d)。将pGL3-Kap147/Kpn-Cre和pCMV-EGFP-stop-RFP质粒共转染到OK、LLC-MK2、COS-7和A549细胞中,荧光蛋白表达结果见图3。在两个肾上皮组织来源的OK和LLC-MK2细胞中,当单独转染pCMV-EGFP-stop-RFP质粒时,细胞表达绿色荧光蛋白,当共转染pCMV-EGFP-stop-RFP和pGL3-Kap147/Kpn-Cre时,在Cre重组酶的作用下表达红色荧光蛋白。然而,在COS-7(肾纤维细胞)和A549(肺癌上皮细胞)中只表达绿色荧光,未观察到红色荧光。以上结果说明Kap147/Kpn启动子可以引导Cre重组酶在OK和LLC-MK2细胞中特异性表达。

      图  3  Kap147/Kpn启动子引导Cre重组酶的细胞特异性表达    

      Figure 3.  Cell-specific Cre recombinase expression driven by Kap147/Kpn hybrid promoter in cultured cells

    • 通过原核显微注射,我们成功构建了7只阳性转基因首建鼠(Cre-F0-1~Cre-F0-7)。每只首建鼠分别与野生型FVB/N小鼠杂交,独立繁殖建立了7个转基因小鼠系。在其中4个转基因小鼠系中未发现Cre基因的表达,或者表达非常微弱。在2个转基因小鼠系(Cre-F0-1和Cre-F0-6)中,检测到了肾脏特异性的Cre重组酶表达。同时在Cre-F0-2小鼠系中,Cre重组酶特异性在雄性小鼠睾丸组织中表达。RT-PCR检测结果显示Cre重组酶mRNA仅出现在小鼠睾丸组织中,而在心、肺、肝、肾、脾和卵巢等其他主要器官中几乎检测不到,内源性Kap基因mRNA表达则主要出现在肾脏组织和少量的睾丸组织中(图4(a)图4(b))。为了进一步准确分析Cre基因在转基因小鼠不同组织中的表达,用荧光定量PCR对不同组织中Cre mRNA进行了定量分析,结果见图4(c)图4(d)Kap147/Kpn杂合启动子引导的Cre重组酶基因在睾丸组织中的表达量是其他组织的几千倍,而内源性Kap基因则主要在肾脏中表达。

      图  4  Cre基因和Kap基因在Cre-F0-2转基因小鼠不同组织中的表达

      Figure 4.  Transgenic Cre and endogenerous Kap gene expression in the offspring of transgene mice Cre-F0-2

    • 体外细胞实验结果显示,Kap147/Kpn杂合启动子的活性受到雄激素的显著调控。睾丸组织主要功能除了生成精子外,还是雄激素的主要分泌器官。睾丸分泌雄激素的量随着动物年龄的增加呈现先增加后减少的趋势[13]。为了初步探索Kap147/Kpn杂合启动子在小鼠体内受雄激素调控的情况,采用荧光定量PCR对不同年龄段Cre-F0-2子代小鼠睾丸组织中Cre基因的表达量进行了分析,如图5(a)5(b)所示,成年小鼠(约6~20周龄)睾丸组织中Cre mRNA的表达量最高,约为幼年小鼠(小于1周龄)或老年小鼠(大于48周龄)的20~30倍,这种成年期高而幼年和老年期低的基因表达模式与性激素在不同发育年龄的分泌规律相似。

      图  5  Cre基因在睾丸组织中的表达受雄激素的调控

      Figure 5.  Androgen regulated expression of Cre gene in the testis

      为了进一步验证雄激素对Kap147/Kpn启动子的调控作用,分别用雄激素DHT和雄激素抑制剂CAP处理小鼠,连续处理10 d后荧光定量PCR检测Cre mRNA表达量,结果见图5(c)。结果显示,15 mg/(kg·d) DHT诱导使转基因小鼠睾丸组织中Cre基因表达上升约1.7倍,100 mg/(kg·d) CAP使Cre基因的表达降低了约50%。以上结果证明Kap147/Kpn杂合启动子在Cre-F0-2转基因小鼠体内的表达位置虽然发生了转移,但其仍然保留了受雄激素调控的特性。

    • 为了验证Cre-F0-2转基因小鼠体内Cre重组酶活性及介导DNA重组的能力,评价其用于基因打靶的可行性,将Cre-F0-2小鼠与mT/mG双荧光报告鼠进行杂交。该荧光报告鼠在自然情况下全身表达膜定位红色荧光蛋白,当Cre重组酶介导基因重组后表达膜定位绿色荧光蛋白,其基因重组示意如图6(a)。杂交、筛选Cre,mT/mG双转基因小鼠,分离器官,制作冰冻切片在荧光显微镜下观察,荧光结果如图6(b)。结果显示在心脏和肝脏组织中没有检测到绿色荧光,在肾脏和卵巢组织中有微弱的绿色荧光,而只在睾丸组织中检测到了明亮的绿色荧光。另外,所有组织中均能检测到明亮的红色荧光。这证明Kap147/Kpn杂合启动子可以成功引导Cre重组酶进行睾丸组织特异性的基因重组,尽管这种重组是不完全的。

      图  6  Cre重组酶在双荧光报告鼠体内介导基因重组

      Figure 6.  Gene recombination mediated by cre recombinase in Kap147/Kpn-Cre/mT-mG double transgenic mice

    • Cre/Loxp系统是研究睾丸发育和功能的一种主要方法,它可以特异性地完成基因的插入、敲除和突变,帮助我们更加精确地研究基因在睾丸中的生理功能。这种依赖Cre重组酶的条件性基因打靶需要构建睾丸特异性的Cre转基因鼠,从而将基因重组限制在特定的组织细胞和特定的发育时间内。本研究利用Kap147/Kpn杂合启动子引导Cre重组酶构建了转基因小鼠,在Cre-F0-2转基因小鼠系中,Cre重组酶的表达被特异性地限制在睾丸组织中,并且其表达量受到雄激素的调控。尽管该转基因小鼠中Cre基因的表达量不像内源性Kap基因一样丰富,但通过与双荧光报告鼠杂交证明Cre-F0-2转基因小鼠可以成功介导睾丸组织特异性的基因重组。

      体外细胞共转染证实Kap147/Kpn杂合启动子可以引导肾上皮细胞特异性的基因表达,然而在Cre-F0-2转基因小鼠中,Kap147/Kpn启动子却引导Cre基因在睾丸组织中表达,这种表达位置的转移是我们未预料到的。转基因在动物体内的表达受到染色质结构、插入位点上下游基因序列、体内转录因子以及启动子结构等多方面的影响。基因的随机插入会导致目标基因受到插入位点附近调控序列或增强子序列的影响,这可能是导致这种异位表达的一个重要原因。另外值得注意的是,Kap启动子本身具有引导基因在部分肾外组织表达的能力。Kasik等[4]的研究结果证实Kap基因除了在肾脏表达外,还在怀孕13 d的雌鼠子宫中表达。Ding等[5]同样证实Kap基因可以在附睾和某些生殖器官中表达。Malstrom等[14]利用突变的1.5 kb Kap启动子成功引导Luc荧光素酶在转基因小鼠肾脏中表达,但是除了肾脏之外他们还在睾丸、附睾、储精囊、卵巢和子宫中检测到了强烈的Luc基因表达。他们认为1.5 kb的Kap启动子虽然包含了引导外源基因在肾脏上皮细胞中表达的主要元件,但是它可能缺少了部分上游顺式元件,这部分序列可能与基因在肾外组织表达的负调控有关。由于Kap147启动子在1.5 kb Kap启动子的基础上进行了进一步的截短,我们猜想Cre基因在睾丸组织中表达可能同样与缺少某些上游调控元件有关。

      尽管Kap147/Kpn启动子引导Cre基因靶向睾丸细胞的机理还不是很清楚,但是其良好的组织特异性仍然可作为睾丸基因功能研究的工具。之前的研究中,Kido等已经利用睾丸组织特异性的启动子引导Cre重组酶构建了几个转基因工具鼠,如睾丸特异性蛋白启动子(TSPY)[15]、人水通道蛋白2启动子(AQP2)[16]和雄激素结合蛋白启动子(Abpa)[17]等。与这些启动子相比,Kap147/Kpn启动子除了具有睾丸特异性外,同时又可被雄激素诱导。Cre-F0-2转基因小鼠中随年龄同步变化的Cre重组酶表达可以使与发育相关基因的研究更加精确。本研究体外细胞实验证明Kap147/Kpn可被15 nmol/L雄激素诱导约7.7倍,体内实验进一步证明转基因鼠睾丸中Cre mRNA可被二氢睾酮诱导增加约1.7倍,并且表达量随小鼠年龄的变化而改变。范立强等[9-10]通过定点突变在Kap147启动子的−124和−39位点中鉴定了2个雄激素应答元件(AREs),同时,在Kpn增强子序列中也发现了一个AREs位点[10-11]Kap147/Kpn杂合启动子引导外源基因在转基因小鼠体内受到雄激素的调控可能得益于其启动子序列中的AREs元件。

(6)  表(1) 参考文献 (17) 相关文章 (3)

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