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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
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可用于电子顺磁共振检测的pH响应载药胶束的制备与体外评价

    作者简介: 王兆东(1993-),男,内蒙古巴彦淖尔市人,硕士生,研究方向纳米载药材料。E-mail:490229890@qq.com;
    通讯作者: 蓝闽波, minbolan@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: TQ317

EPR-Detectable and pH-Responsive Drug-Loaded Micelles: Preparation and in vitro Evaluation

    Corresponding author: Minbo LAN, minbolan@ecust.edu.cn
  • CLC number: TQ317

  • 摘要: 基于乙炔聚合反应,以席夫碱作为酸响应基团,合成了含有2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(TEMPO)自由基的pH响应聚合物PA-pH-TEMPO,利用核磁共振氢谱(1H-NMR)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、电子顺磁共振波谱(EPR)等对其分子结构进行了表征;以广谱抗肿瘤药物阿霉素(DOX)为模型药物,通过透析法制得了载DOX的胶束DOX@PA-pH-TEMPO。结果表明,PA-pH-TEMPO在对小鼠成纤维细胞L929和人子宫癌细胞HeLa的毒性测试中,没有明显的细胞毒性;DOX@PA-pH-TEMPO胶束的载药量和包封率分别为2.58%和32.09%,表现出良好的pH响应特性和缓释性能,且对HeLa肿瘤细胞具有较强的抑制效果。对PA-pH-TEMPO和DOX@PA-pH-TEMPO的体外细胞摄取实验表明,HeLa细胞对材料具有良好的摄取效果,并可检测到明显的EPR信号。
  • 图 1  单体12的合成路线

    Figure 1.  Synthetic routes of derivatives 1 and 2

    图 2  pH响应型载药胶束的示意图(a)和PA-pH-TEMPO与TEMPOL的EPR谱图(b)

    Figure 2.  Schematic illustration of the pH-sensitive DOX-loading micelles (a) and EPR of PA-pH-TEMPO and TEMPOL (b)

    图 3  单体12和聚合物PA-pH-TEMPO的1H-NMR谱(a)和FT-IR谱(b)

    Figure 3.  1H-NMR (a) and FT-IR (b) spectra of 1, 2 and PA-pH-TEMPO

    图 4  PA-pH-TEMPO(a)和DOX@PA-pH-TEMPO(b)的TEM图像

    Figure 4.  TEM images of PA-pH-TEMPO (a) and DOX@PA-pH-TEMPO (b)

    图 5  37 ℃下载药胶束DOX@PA-pH-TEMPO在不同pH的PBS介质中的累积释放曲线

    Figure 5.  In vitro drug release profile of DOX@PA-pH-TEMPO at 37 ℃ in PBS buffer at different pH

    图 6  载药胶束和阿霉素对HeLa细胞培养24 h(a) ,48 h(b) ,72 h(c) 和对L929细胞培养72 h(d)时的细胞活性

    Figure 6.  In vitro cytotoxicity of DOX and DOX@PA-pH-TEMPO against HeLa after 24 h(a), 48 h(b), 72 h incubation (c) and against L929 after 72 h incubation (d)

    图 7  DOX@PA-pH-TEMPO培养4 h后HeLa细胞的CLSM图像(a);TEMPOL和PA-pH-TEMPO培养后的细胞液的EPR谱图(b)

    Figure 7.  CLSM images of HeLa cells after incubation with DOX@PA-pH-TEMPO for 4 h(a) ; EPR spectra of cell suspension after incubating with TEMPOL and PA-pH-TEMPO, respectively(b)

    表 1  空白胶束及载药胶束的部分性质

    Table 1.  Properties of the blank and DOX-loaded micelles

    Micelle LC/% EE/% Size/nm PDI Zeta potential/mV
    Blank micelle 227.1 0.220 9.16
    DOX-loaded micelle 2.58 32.09 298.0 0.146 7.93
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-07-30
  • 网络出版日期:  2019-10-09

可用于电子顺磁共振检测的pH响应载药胶束的制备与体外评价

    作者简介:王兆东(1993-),男,内蒙古巴彦淖尔市人,硕士生,研究方向纳米载药材料。E-mail:490229890@qq.com
    通讯作者: 蓝闽波, minbolan@ecust.edu.cn
  • 1. 华东理工大学化学与分子工程学院,上海市功能性材料化学重点实验室,上海 200237
  • 2. 华东理工大学分析测试中心,上海 200237

摘要: 基于乙炔聚合反应,以席夫碱作为酸响应基团,合成了含有2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(TEMPO)自由基的pH响应聚合物PA-pH-TEMPO,利用核磁共振氢谱(1H-NMR)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、电子顺磁共振波谱(EPR)等对其分子结构进行了表征;以广谱抗肿瘤药物阿霉素(DOX)为模型药物,通过透析法制得了载DOX的胶束DOX@PA-pH-TEMPO。结果表明,PA-pH-TEMPO在对小鼠成纤维细胞L929和人子宫癌细胞HeLa的毒性测试中,没有明显的细胞毒性;DOX@PA-pH-TEMPO胶束的载药量和包封率分别为2.58%和32.09%,表现出良好的pH响应特性和缓释性能,且对HeLa肿瘤细胞具有较强的抑制效果。对PA-pH-TEMPO和DOX@PA-pH-TEMPO的体外细胞摄取实验表明,HeLa细胞对材料具有良好的摄取效果,并可检测到明显的EPR信号。

English Abstract

  • 纳米尺度药物输送系统(Nano-scale Drug Delivery Systems, Nano-DDS)的提出[1],为各类药物尤其是难溶性抗癌药物的体内输送提供了一个很好的途径。Nano-DDS可以提高药物的溶解性,延长药物在体内的循环时间,还可以利用肿瘤部位的增强滞留效应实现药物在肿瘤处的被动富集[2]。在诸多纳米药物输送体系中,聚合物胶束以其优良的内吞性能、良好的被动靶向效果和药物包封能力,成为了目前最常用的药物载体之一[3]

    为了实现药物的可控释放,已经出现了多种对温度、pH、酶、光等刺激做出响应的聚合物胶束[4-7],其中能够对肿瘤组织处弱酸性环境做出响应的pH响应型胶束得到了广泛研究。pH响应胶束通常含有可以离子化的基团或酸敏感的化学键,当环境pH发生变化时,这些基团发生结构改变导致胶束不稳定,实现药物释放。例如,Liang等[8]设计了一种新型的两亲性多肽,自组装形成可用于药物输送的pH响应性胶束。该胶束在酸性条件下2 h内即可释放45%的药物;而在中性条件下,120 h也只有20%的药物释放。借助pH响应胶束可以实现对药物的控制释放,使得药物在时间、空间上有更好的分布,从而延长给药间隔,降低药物毒副作用,提高药物利用率。

    聚乙炔衍生物以其良好的生物相容性,特有的光学活性,在药物输送领域得到越来越多的关注。通过对聚乙炔取代基的修饰,例如连接可酸解的化学键,如腙键、亚胺、肟等,可以实现药物在酸性条件下的可控释放[9]。其中,席夫碱是一类拥有碳氮双键结构的不稳定亚胺类化合物,在酸性条件下易于分解。基于这一性质,席夫碱也被用作可分解的连接基团来制备药物可控释放的药物输送系统。例如,Ke等[10]用席夫碱将阿霉素(DOX)和亲水性聚合物相连制得具有pH响应功能的胶束用于药物可控释放。

    氮氧自由基化合物是一类具有顺磁性、相对稳定的自由基化合物,其中2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(TEMPO)应用广泛。TEMPO以其良好的顺磁性,在用作磁共振成像(MRI)的造影剂方面已有大量研究[11-12]。Yoshitomi等[13]研究发现TEMPO可以在增强阿霉素(DOX)抗肿瘤活性的同时抑制DOX对正常组织的副作用。因此,TEMPO自由基作为一种功能多样的化合物可被用于肿瘤的电子顺磁共振(Electron Paramagnetic Resonance,EPR)检测、成像和治疗中。

    本文以席夫碱作为酸响应基团,合成了含有TEMPO功能性基团的pH响应聚合物PA-pH-TEMPO,同时制备了包封抗癌药物DOX的载药胶束DOX@PA-pH-TEMPO,并对聚合物及载药胶束的结构及应用性能进行表征及评价。

    • 炔丙胺(纯度98%)购自上海韶远试剂有限公司;4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基(TEMPOL)(纯度98%)、氯降冰片二烯铑二聚体([Rh(nbd)Cl]2)(纯度96%)等购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;盐酸阿霉素(DOX·HCl)(纯度98%)购自上海毕得医药科技有限公司;聚乙二醇-2000(PEG-2000,化学纯)购自国药集团;丁二酸酐、对氨基苯酚及其他常用试剂均购自上海泰坦科技股份有限公司;胎牛血清、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)细胞培养基、胰蛋白酶购自GIBCO公司;青霉素-链霉素双抗溶液购自HyClone公司。

    • 人宫颈癌HeLa细胞,小鼠成纤维L929细胞,购自上海生命科学研究院。

    • 核磁共振波谱仪(NMR,AVANCE Ⅲ 400,400 MHz,瑞士Bruker公司);傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR,Thermo Nicolet AVATA360,美国Thermo Fisher公司);透射电子显微镜(TEM,JEM-2100,日本电子株式会社);电子顺磁共振波谱仪(EPR,100G-18KG/EMX-8/2.7,美国Bruker公司);动态光散射仪(DLS, Beckman Coulter Delsa TM Nano,美国Beckman Coulter公司);紫外-可见吸收光谱仪(EVOLUTION 220,美国Thermo scientific公司);激光扫描共聚焦显微镜(CLSM,Nikon A1R,日本Nikon公司)。

    • 首先合成含氮氧自由基的乙炔衍生物(单体1)和含pH响应基团的乙炔衍生物(单体2),合成路线如图1所示。合成方法参照文献[14]稍作修改。

      图  1  单体12的合成路线

      Figure 1.  Synthetic routes of derivatives 1 and 2

      单体1的合成:将丁二酸酐(13 mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(15 mmol)溶于无水二氯甲烷(CH2Cl2)中,加入TEMPOL(10 mmol),室温反应过夜。反应液依次用质量分数为5%的Na2CO3溶液、0.5 mol/L HCl溶液洗涤,CH2Cl2萃取后旋干。将所得产物(1 mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(1 mmol)溶于CH2Cl2,氮气保护下加入0.1 mL炔丙胺和DMAP(2 mmol),冰水浴下反应1 h后升至室温继续反应过夜。碱洗、酸洗后旋干溶剂,柱色谱分离(石油醚和乙酸乙酯体积比为4∶1),得橙红色固体,为单体1

      单体2的合成:取丁二酸酐(20 mmol)和DMAP(20 mmol)溶于无水CH2Cl2中,氮气保护下滴加1 mL炔丙胺,冰水浴反应0.5 h后升至室温,继续反应1 h。反应液用30 mL饱和Na2CO3溶液洗涤,水相用1 mol/L HCl溶液调节pH至3~4,用乙酸乙酯萃取,旋除有机溶剂后得白色固体。取所得白色固体(2 mmol)和EDC·HCl(2 mmol)溶于CH2Cl2中,室温反应1 h,加入DMAP(1 mmol)和叔丁氧羰基(BOC)保护的对氨基苯酚(2 mmol),反应过夜。碱洗、酸洗后旋干溶剂,粗产物以柱色谱分离(石油醚和乙酸乙酯体积比为2∶1),得白色固体。用三氟乙酸脱除保护基因,薄层色谱(TLC)检测反应完全后,旋除大部分溶剂,剩余物溶于无水乙醇。加入醛基化PEG-2000和少量无水Na2SO4除水,氮气保护下,80 ℃回流反应1 h,过滤后浓缩反应液,在无水乙醚中析出,重结晶后干燥得浅黄色固体,为单体2

      通过单体1和单体2的乙炔聚合反应得到pH响应型聚合物PA-pH-TEMPO,其合成步骤(如图2所示)为:将单体1(1.6 mmol)和单体2(2 mmol)溶于5 mL无水甲苯中,超声至反应物完全溶解,加入1 mL溶有[Rh(nbd)Cl]2(0.000 6 mmol)的甲苯溶液。在氮气保护下60 ℃反应5 h,将反应液倒入无水乙醚中,析出棕色沉淀,过滤并用少量水溶解固体,置于MWCO 7000透析袋中,于水中透析24 h,冷冻干燥,得到浅棕色固体聚合物PA-pH-TEMPO。

      图  2  pH响应型载药胶束的示意图(a)和PA-pH-TEMPO与TEMPOL的EPR谱图(b)

      Figure 2.  Schematic illustration of the pH-sensitive DOX-loading micelles (a) and EPR of PA-pH-TEMPO and TEMPOL (b)

    • 取20 mg DOX·HCl溶于10 mL DMSO中,并加入10 mg三乙胺除去HCl。将99.5 mg PA-pH-TEMPO溶于4 mL该溶液中,搅拌30 min,然后缓慢加入6 mL水,随后转移至透析袋MWCO 7000内,避光条件下对水透析24 h。结束后,透析袋内部分溶液用于体外释药实验,剩余溶液全部冷冻干燥后保存。

    • 分别取3 mL新鲜制备的DOX@PA-pH-TEMPO溶液加入透析袋内,透析袋密封后置于60 mL释放介质中,置于恒温摇床培养(37 ℃,200 r/min)。释放介质分别为pH 7.4、6.5、5.3的20 mmol/L 磷酸盐缓冲(PBS)溶液。分别于0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5.5、15、17、20、24、28、40、52、64、88、112、136、160、184、208 h取出3 mL释放介质用于测试,同时补充相应体积的新鲜介质。用紫外-可见分光光度计于481 nm处测定释放介质中DOX的浓度,根据标准曲线计算药物的释放量,以累积释放百分率对时间作图。

    • 使用噻唑蓝(MTT)法,以PA-pH-TEMPO对HeLa细胞和L929细胞进行细胞毒性测试。细胞培养于添加青霉素-链霉素双抗溶液、含体积分数10%胎牛血清的DMEM细胞培养基中,在37 ℃、体积分数5% CO2的细胞培养箱中培养。待细胞处于对数生长期时,将细胞接种于96孔板中(每孔5 000个细胞)。放置于细胞培养箱中孵育24 h,观察到细胞贴壁生长。吸去96孔板中剩余培养液,加入200 μL溶有PA-pH-TEMPO的培养液继续培养一定时间。用培养液将5 mg/mL的MTT溶液稀释至0.5 mg/mL,吸去96孔板中剩余培养液,加入200 μL稀释后的MTT,培养4 h。吸去剩余培养液,加入150 μL DMSO,振荡60 s,在492 nm波长下,用酶标仪测定光密度值(Optical Density,OD)。以实验组OD值除以对照组OD值计算细胞的存活率,用百分数表示。

      使用相同方法测试载药胶束DOX@PA-pH-TEMPO对HeLa细胞的抑制率,并以游离DOX为对照。

    • 使用激光共聚焦显微镜(CLSM)考察HeLa细胞对DOX@PA-pH-TEMPO的摄取能力。将细胞接种于CLSM培养皿中(约3×104个),待细胞贴壁生长后加入1.5 mL细胞培养基培养24 h,更换为含DOX 2.5 μg/mL的DOX@PA-pH-TEMPO的细胞培养基继续培养4 h。吸去剩余培养液,用PBS冲洗3遍后,用0.5 mL 40g/L多聚甲醛溶液固定细胞30 min,PBS冲洗后加入0.5 mL 1g/L曲拉通处理15 min,PBS冲洗后再用0.5 mL Hoechst 33258染色液(5 μg/mL)染色3~5 min,用PBS冲洗多次后加入1.5 mL PBS待测。激发波长分别选择404 nm和488 nm,使用DAPI通道和TRITC通道分别观察细胞核染色情况和DOX摄取情况。

      使用EPR检测TEMPO自由基的顺磁信号,验证L929细胞对PA-pH-TEMPO的摄取情况。使用同上的方法接种细胞,更换为含500 μg/mL的PA-pH-TEMPO或TEMPOL的细胞培养基继续培养12 h。吸取原培养基,PBS冲洗2次后加入胰酶消化,用150 μL PBS制成细胞悬液用于EPR测试。

    • 聚合物通过单体1和单体2的乙炔聚合反应得到,各步产物及终产物结构用1H-NMR进行表征,同时结合FT-IR对单体12及PA-pH-TEMPO的结构进行确定,结果如图3所示。图3(a)中,化学位移3.6,4.0和6.9处的峰分别为单体2和PA-pH-TEMPO中PEG亚甲基,碳氮双键和苯环上质子的吸收峰。在单体12中,化学位移2.2处为端炔氢的吸收峰,它在PA-pH-TEMPO中没有出现,证明单体12中的炔基通过聚合反应形成了聚合物中单双键交替的结构。为进一步确定PA-pH-TEMPO的结构,采用FT-IR分别测定单体12及PA-pH-TEMPO的红外特征吸收峰,如图3(b)所示,单体12中3 280 cm−1附近的端炔氢的振动峰在PA-pH-TEMPO中没有出现,证明确实发生了聚合反应。

      图  3  单体12和聚合物PA-pH-TEMPO的1H-NMR谱(a)和FT-IR谱(b)

      Figure 3.  1H-NMR (a) and FT-IR (b) spectra of 1, 2 and PA-pH-TEMPO

      EPR波谱被用于确定PA-pH-TEMPO中TEMPO自由基的存在,TEMPOL被用作对照,其结果如图2(b)所示。可以看出,PA-pH-TMEPO表现出和TEMPOL相似的EPR信号,这是典型的氮氧自由基中电子自旋和14N原子核自旋共振所产生的三线态超精细裂分[15-16]。因此可以充分说明所制得的PA-pH-TEMPO中含有TEMPO基团。

    • 使用透射电子显微镜(TEM)对制得的空白胶束PA-pH-TEMPO及载药胶束DOX@PA-pH-TEMPO的形貌进行表征,结果如图4所示。粒径、多分散指数(PDI)及Zeta电位用动态光散射仪(DLS)测定,载药量(Loading Content, LC)及包封率(Entrapment Efficiency, EE)用紫外-可见分光光度计测定,结果见表1

      图  4  PA-pH-TEMPO(a)和DOX@PA-pH-TEMPO(b)的TEM图像

      Figure 4.  TEM images of PA-pH-TEMPO (a) and DOX@PA-pH-TEMPO (b)

      Micelle LC/% EE/% Size/nm PDI Zeta potential/mV
      Blank micelle 227.1 0.220 9.16
      DOX-loaded micelle 2.58 32.09 298.0 0.146 7.93

      表 1  空白胶束及载药胶束的部分性质

      Table 1.  Properties of the blank and DOX-loaded micelles

      图4中可以看出载药胶束和空白胶束均为均匀分散的球状颗粒。空白胶束的粒径约为110 nm,载DOX后的粒径约为140 nm,包封前后粒径变化不大。但TEM观察到的粒径与DLS结果差异较大,这是因为制样方法和测试手段不同而导致[17]。TEM制样过程中需将胶束溶液晾干,并在真空下检测,导致形成的胶束进一步塌陷;而DLS是在溶液状态下测试,胶束会有一定的溶胀效果,而且DLS测定的是颗粒的水合半径,因此所得的结果通常要比TEM测定的结果大。

      在测试过程中发现,空白胶束与载药胶束相比更易团聚形成大粒径的颗粒,这可能是因为在未包封DOX时,PA-pH-TEMPO的疏水性片段较亲水性片段更短,难以形成稳定的亲水-疏水的核壳结构,因而倾向于团聚成更为稳定的大颗粒。而包封DOX后,DOX与疏水性片段相互作用形成较为稳定的疏水性“内核”,使形成的核壳结构更为稳定。这也解释了下文药物释放实验中DOX难以释放的原因。

      此外,Zeta电位测定结果显示所形成的胶束均带少量正电,这使得胶束可以通过静电作用与带负电的细胞膜相互吸引,有利于胶束被细胞内吞,进而促进药物释放[18-19]

    • 在聚合物PA-pH-TEMPO中,疏水性片段和亲水性片段(PEG)通过可酸解的席夫碱相连,在酸性条件下会导致胶束结构破坏从而释放阿霉素。由于多数肿瘤组织处于微酸性环境,选择pH 6.5和pH 5.3的缓冲溶液分别模拟肿瘤组织间隙[20]和肿瘤细胞内涵体[21]的pH环境。图5为载药胶束DOX@PA-pH-TEMPO在3种不同pH(7.4、6.5、5.3)缓冲溶液中的体外释放图。由图可知,在正常生理条件下(pH 7.4),只有少量(23%)DOX释放,且随时间延长不再释放。而在酸性条件下(pH 5.3和pH 6.5),DOX的释放速率明显加快,最终释放量也显著增多,分别达到62%和53%。这表明在酸性条件下席夫碱中碳氮双键断裂会造成聚合物结构中亲水-疏水结构彻底被破坏,导致DOX释放。

      图  5  37 ℃下载药胶束DOX@PA-pH-TEMPO在不同pH的PBS介质中的累积释放曲线

      Figure 5.  In vitro drug release profile of DOX@PA-pH-TEMPO at 37 ℃ in PBS buffer at different pH

      释放曲线还表明了DOX的体外释放存在两个阶段:第一阶段,DOX快速释放,速率几乎不受pH影响;第二阶段,DOX释放变缓,在正常条件下甚至停止释放,这可以由聚合物特殊的结构进行解释。正如前文中讨论的,部分DOX会和疏水性片段形成紧密的“核”,这部分DOX只会随着席夫碱水解导致亲水-疏水结构破坏而逐渐释放,释放速率与席夫碱的水解速率相关;另一部分DOX只是简单包埋至胶束中,因此会快速释放,释放速率与pH无关。

      实验结果表明,聚合物PA-pH-TEMPO有良好的pH响应性。在中性条件下较为稳定,有助于减少药物在体内循环过程中的泄露;在弱酸性条件下,席夫碱作为pH敏感“开关”控制了药物释放,可实现药物的持续释放。尽管最终药物释放率仍有较大提升空间[8],但与某些已报道的材料[22-23]相比,聚合物PA-pH-TEMPO在酸性条件下可以达到相同的释放水平,且在中性条件下可保持更好的稳定性。

    • 选取正常细胞(L929)和肿瘤细胞(HeLa),采用MTT法对聚合物PA-pH-TEMPO进行体外细胞毒性检测。结果表明即使聚合物作用于细胞48 h,也未对细胞活性产生明显影响,仍保持在80%以上。说明该材料对细胞基本无毒,且具有良好的生物相容性。

      随后采用MTT法考察胶束DOX@PA-pH-TEMPO对肿瘤细胞(HeLa)和正常细胞(L929)的生长抑制效果,其结果如图6所示。当给药时间较短(24 h)时,游离DOX的细胞毒性要明显强于载药胶束,这与药物摄取的途径有关,即游离DOX作为一种小分子药物可以通过被动扩散直接进入细胞;而载药胶束则需要通过细胞内吞作用进入细胞,因此,慢于被动扩散[18, 24]。给药48 h后,载药胶束中的DOX逐渐释放,与游离DOX相比对细胞毒性差异减小。继续延长给药时间至72 h,载药胶束与游离DOX的差异进一步减小,且在较高给药浓度时取得了与游离DOX一致的药效。这说明DOX@PA-pH-TEMPO有明显的缓释效果。而正常细胞L929中,由于没有偏酸性的微环境,DOX@PA-pH-TEMPO胶束释药缓慢,延长给药时间至72 h时,仍具有较高的细胞活性。这一结果与体外模拟药物释放结果相吻合,进一步证明了材料的pH响应功能。

      图  6  载药胶束和阿霉素对HeLa细胞培养24 h(a) ,48 h(b) ,72 h(c) 和对L929细胞培养72 h(d)时的细胞活性

      Figure 6.  In vitro cytotoxicity of DOX and DOX@PA-pH-TEMPO against HeLa after 24 h(a), 48 h(b), 72 h incubation (c) and against L929 after 72 h incubation (d)

    • 采用CLSM研究胶束进入细胞及在细胞内的分布情况,以DOX自身为荧光探针,使用Hoechst 33258染色液定位细胞核。图7(a)为载药胶束DOX@PA-pH-TEMPO细胞摄取情况的CLSM图像。可以看到大量DOX快速进入细胞,且与细胞核高度重合,细胞对载药材料摄取情况良好。这表明载药胶束可以有效地进入细胞内部,在包封荧光药物后,实现对细胞的体外标记。但由于载药材料未被荧光标记,仍不能确定胶束是否整体被细胞摄取。因此,我们利用EPR波谱对细胞内的TEMPO自由基进行检测,进而反映细胞对胶束的摄取状况。实验结果如图7(b)所示。在PA-pH-TEMPO组和TEMPOL组中检测到了微弱的TEMPO自由基的EPR信号(图中红线范围),而在空白对照组中未出现,这说明细胞对PA-pH-TEMPO和小分子的TEMPOL有一定的摄取效果。结合CLSM实验结果,我们可以确定细胞对PA-pH-TEMPO有着良好的摄取能力。

      图  7  DOX@PA-pH-TEMPO培养4 h后HeLa细胞的CLSM图像(a);TEMPOL和PA-pH-TEMPO培养后的细胞液的EPR谱图(b)

      Figure 7.  CLSM images of HeLa cells after incubation with DOX@PA-pH-TEMPO for 4 h(a) ; EPR spectra of cell suspension after incubating with TEMPOL and PA-pH-TEMPO, respectively(b)

    • 本文将含TEMPO自由基的单体与含席夫碱的可降解单体聚合得到具有pH响应性的聚合物PA-pH-TEMPO,该聚合物具有细胞毒性低、生物相容性好的特点。进一步制备了载DOX的胶束DOX@PA-pH-TEMPO,该胶束表现出对HeLa肿瘤细胞明显的抑制效果;在体外药物释放实验中展现出良好的pH响应性能,在pH较低的环境中有更高的药物释放率,因此该载药胶束可用于癌症治疗,以减少药物对正常组织的毒副作用,同时提高治疗效果。体外细胞摄取实验中表现出良好的细胞摄取效果,且可用于体外细胞的EPR检测,也有利于研究载药胶束在体内的分布代谢过程。该聚合物还可能被用于如紫杉醇等多种疏水性抗癌药物的输送,研究为实现功能纳米药物输送系统在肿瘤处的药物可控释放和检测提供了基础和新的思路。

(7)  表(1) 参考文献 (24) 相关文章 (20)

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