罗丹明的荧光性质易受到外部环境的影响，在不同的外部环境（例如不同的极性、pH值、氢键以及金属离子的相互作用等）条件下，罗丹明染料往往表现出不同的荧光性质。同时，化学结构的变化也显著影响罗丹明的荧光性质，罗丹明染料荧光性质的内在和外在影响因素如图2所示。如杂蒽环取代基（R₁）的改变会影响罗丹明染料的荧光波长以及相应的荧光量子效率；桥连原子（R₂）的改变通常会改变罗丹明的能级轨道，发生荧光光谱的红移或者蓝移；而苯环部分功能单元（R₃和R₄）的引入通常作为检测基团用于检测相关物质的响应受体。

图  2  罗丹明染料荧光性质的内在和外在影响因素

Figure 2.  Intrinsic and extrinsic influence factors on rhodamine fluorescent properties

针对如何将罗丹明染料的荧光发射拓展至近红外区域这一问题，目前已经提出了多种策略。例如：延长罗丹明杂环的共轭结构；在中心碳原子上引入吸电子基团或者用其他元素（如N、C、S、Se、Te等）取代桥连氧原子等^[8-9]。然而，上述波长拓展方法不仅合成难度通常较大，还存在着一定程度的吸收问题和荧光强度减弱问题，很难满足生物成像的实际应用需求。

值得注意的是，在取代桥连氧原子的众多元素中，硅原子作为桥连单元具有独特的电子轨道以及易于合成的显著优势。因此，硅原子取代是一种简单易行的构建光物理性质优异的近红外罗丹明染料的分子工程策略。如图3所示，用二甲基硅基团取代荧光团派诺宁（Pyronine Y）的10号位氧原子，成功实现了罗丹明染料荧光发射波长的拓展^{[6, 10]}，相关数据见表1。由于桥连原子的改变，TMDHS的吸收和荧光波长红移90 nm左右。通过计算，波长的拓展可归结于硅原子的取代导致了分子最高占有轨道（HOMO）和分子最低未占有轨道（LUMO）能级轨道的变化，以及能级轨道差的减少^[11]。由于硅原子与两个甲基的δ*轨道与杂蒽部分的π*轨道相互作用，形成δ*-π*轨道的共轭，使TMDHS具有较低的LUMO能级轨道。较高的HOMO能级轨道主要是由于二甲基硅基团与氧原子相比具有更强的给电子能力所致^[12]。相较于氧取代罗丹明，硅取代的衍生物不仅其发射波长可红移至近红外区域，并且保留了传统罗丹明染料优异的光物理性质，比如耐光漂白性、pH稳定性以及在细胞线粒体的定位性能等^[13-14]。

图  3  Pyronine Y和TMDHS的光物理性质和能级轨道^[6，10]

Figure 3.  Photophysical properties and calculated orbital energy of pyronine Y and TMDHS^{[6, 10]}

与罗丹明染料相比，尽管硅罗丹明TMDHS的荧光发射波长有着很明显的红移，然而在活体成像中，由于组织透明度和背景荧光的需求，通常需要构建系列发射波段的荧光染料。为此，需要通过进一步结构修饰，发展系列波长的近红外染料。首先，通过扩大氧杂蒽环延长荧光波长，系列发射波段的硅罗丹明染料SiR600、SiR650、SiR680、SiR700和SiR720被成功构建（图4）^[15-18]，其光物理性质相关数据见表2。其次，为提高硅罗丹明的荧光量子产率，用氮杂四元环取代传统的N,N-二甲基基团，发展了硅罗丹明SiR664^[19-20]。相比较于其他罗丹明衍生物，SiR664的荧光量子效率有了显著提高，达到了0.54^[20]。SiR664能很好地延长生物成像过程中单分子荧光团的观察时间，使其在荧光成像示踪，尤其在超分辨荧光成像中有着很好的应用前景^[21-22]。

图  4  硅罗丹明的化学结构和光物理性质^[15-18]

Figure 4.  Chemical structures and photophysical properties of SiR-NIRs^[15-18]

Rehm-Weller方程表明，HOMO和LUMO差值越大，光致电子转移（PET）控制机制越有效（图5），即当荧光团的波长越短时，光诱导电子转移的控制效果越好^[23]。与之鲜明对照的是，由于近红外荧光团的能级差较小的原因，光诱导电子转移的控制效果并不理想，故通过光诱导电子转移调控近红外荧光探针存在很大的难度，这也是为何很少有长波长的探针可以实现很强的荧光激活现象。硅罗丹明染料具有较低的LUMO能级轨道，可以通过PET机理很好地调控荧光状态，意味着硅罗丹明不仅具有近红外的荧光波长，而且可以通过PET机理调控荧光发射性质，利用该优点发展了多个系列性能优异的荧光探针。

图  5  PET机理的前线轨道理论^[23]

Figure 5.  PET mechanism by front orbital theory^[23]

华东理工大学朱为宏课题组设计合成了基于硅罗丹明的一氧化氮（NO）探针SiRD (图6(a))^[24]。该探针以邻苯二胺为检测基团，连接在杂蒽基团9号位。由于光诱导电子转移效应的影响，该分子结构并不表现明显的荧光发射。在测试体系中加入NO后，邻苯二胺基团反应生成苯并三氮唑，同时电子转移被切断，探针在710 nm处表现出明显的近红外荧光发射。研究表明，该探针具有响应快速以及灵敏的显著优势，能够实现细胞线粒体内源性NO的实时检测。

图  6  运用PET机理的硅罗丹明荧光探针结构及反应机理^[9，24-25]

Figure 6.  Structure and reaction mechanism of SiR-based fluorescent probes with PET mechanism^{[9, 24-25]}

近年来，溶酶体的药理靶向获得了广泛关注，即通过溶酶体凋亡选择性地杀死癌细胞。这种新型的治疗策略是通过药物刺激产生活性氧物质，从而发生脂质过氧化、破坏溶酶体膜蛋白等反应，增加溶酶体膜的通透性，进而凋亡溶酶体。山西大学郭炜课题组设计合成了具有溶酶体靶向的活性氧检测探针PSiR (图6(b))^[25]。由于光诱导电子转移效应的影响，该分子在初始态表现较弱的荧光发射。当在测试体系中加入活性氧物质（ClO⁻、ONOO⁻和OH⁻）后，由于氮原子上的氢被氧化为羟基，使其电子转移被阻断，进而表现为强荧光发射信号，最终该探针成功实现了对细胞中活性氧的实时监测。

细胞内的绝大多数生理活动都与细胞内的pH变化息息相关，包括细胞内吞作用、酶的催化反应、离子运输以及内稳态等。Nagano课题组发展了pH探针2-Me-5-NH₂ SiR (图6(c))^[9]。由于从苯胺基团到荧光团的光诱导电子转移效应，该探针在非质子化状态下表现弱的荧光信号，而在酸性条件下，由于化合物处于质子化状态时，探针表现为近100倍的显著荧光增强，从而实现对细胞pH的实时监测。

在众多的罗丹明探针中，由于螺环结构的闭环-开环反应具有非常高的信噪比，基于该反应机理设计的罗丹明荧光探针受到广泛关注。当罗丹明处于闭环状态时，在可见光区没有吸收，因此具有非常低的背景荧光。而当响应后发生开环反应时，一般会发生超过100倍的荧光增强现象。近年来基于相应的螺环设计，发展了众多的螺环结构罗丹明荧光探针^{[13, 26]}。图7示出了硅罗丹明探针螺环机理。

图  7  硅罗丹明荧光探针螺环机理

Figure 7.  SiR-based fluorescent probes with the spirocyclization mechanism

在溶酶体中，酸性环境有利于在细胞代谢过程中激活相关的代谢酶，促进蛋白质的降解。当溶酶体中的pH异常时，通常伴随着细胞功能紊乱的发生，故追踪溶酶体中pH的变化对生理以及病理学的研究有很大帮助。在硅罗丹明螺环结构的基础上，王亭课题组设计合成了pH探针SiR-B (图8(a))^[27]。在中性或微碱性的环境中，该探针以螺环的结构存在，并不表现明显的荧光发射信号。在酸性条件下，硼酸盐水解开环，探针表现为明显的荧光信号。研究结果表明，该探针具有优异的溶酶体定位性能，能够实时监测溶酶体pH值。

图  8  基于硅罗丹明螺环反应的荧光探针机理^[27-29]

Figure 8.  SiR-based Fluorescent probes mechanism with the spirocyclization^[27-29]

人体中高浓度的甲醛与众多疾病密切相关，包括癌症、神经退化性疾病、糖尿病、心脏病等。生物甲醛传统的检测方法复杂，不容易实现实时检测细胞内甲醛的含量。针对这一问题，加州大学伯克利分校的Chang课题组设计合成了甲醛探针FAP-1(图8(b))，该探针利用烯丙基胺基团与硅罗丹明形成螺环结构^[28]。在甲醛存在的条件下，烯丙基胺基团与甲醛反应生成醛基并开环，表现出明显的荧光信号，能够实时监测乳腺癌细胞内源性甲醛的含量。

Cu²⁺作为众多氧化还原酶的辅助因子，在生理过程起着重要的作用，包括细胞呼吸、抗氧化防御和离子内稳态等。为实时检测细胞内Cu²⁺的浓度，王亭课题组利用氨基硫脲六元环结合硅罗丹明，发展了Cu²⁺探针SiRB-Cu (图8(c))^[29]。在Cu²⁺存在时，探针开环表现为明显的荧光信号。与五元环结构相比，六元环结构不仅具有很好的耐酸性，而且氨基硫脲基团反应位点还可以作为溶酶体靶向基团。研究表明，该探针成功地实现了线粒体内源性Cu²⁺浓度的检测。

荧光共振能量转移（FRET）是指在一定波长的光激发下，荧光基团中的能量给体产生荧光发射，通过偶极与偶极之间的相互作用把能量无辐射地转移给其附近处于基态的能量受体荧光基的过程。在FRET机理中，首先，能量给体的荧光发射光谱与能量受体的吸收光谱要有一定程度的重叠。其次，给体与受体的距离必须远大于它们之间的碰撞直径，才可能发生给体与受体之间的非辐射能量转移，即长程能量转移^[30]。利用FRET机理，东京大学Urano课题组发展了检测基质金属蛋白酶的荧光探针（图9）^[31]。该探针选择甜菜碱的同类物DY 730作为荧光基团，当没有基质金属蛋白酶存在时，DY 730的荧光是通过荧光共振能量转移被硅罗丹明吸收，并且由于硅罗丹明氮原子上芳香环的转动，吸收的能量转化为动能，表现出荧光淬灭状态。基质金属蛋白酶条件下，连接两个荧光团的肽链发生断裂，FRET被阻断，DY 730的荧光开启。因此，通过荧光信号的OFF-ON响应，该探针能够实时监测生物样本中基质金属蛋白酶的含量。

图  9  运用FRET机理的硅罗丹明荧光探针^[31]

Figure 9.  SiR-based fluorescent probe with FRET strategy^[31]

由于电子分布的影响，硅罗丹明9号位具有较强的亲电性，容易与亲核试剂发生亲电加成反应。利用硅罗丹明9号位的亲电性以及谷胱甘肽（GSH）较强的亲核性，Urano课题组发展了可逆检测GSH的荧光探针PH SiR650（图10）^[32]。在GSH条件下，在硅罗丹明的9号位发生亲核加成，探针的共轭体系被破坏，荧光淬灭。加入硫醇清除剂N-乙基马来酰亚胺（NEM）时，发生亲核反应的GSH被去除，荧光恢复。该探针能够实时、定量检测细胞中GSH含量的变化，对于生理以及病理的研究具有重要意义。

图  10  可逆检测GSH的硅罗丹明荧光探针^[32]

Figure 10.  SiR-based fluorescent probe for detecting GSH in reversible way^[32]

硅取代罗丹明不但具有近红外的荧光波长，还具有摩尔消光系数高、荧光量子产率高和耐光性好等一系列优良的光学性质，已经作为荧光母体在近红外荧光探针以及活细胞内生物标记物的合成方面展现了巨大的应用潜力。尽管硅罗丹明具有特别优秀的光物理性质，但目前其合成与设计仍然存在一定限制。由于硅罗丹明荧光发射波长仍然主要集中在700 nm左右的近红外一区，如何拓展其波长至近红外二区并保持高量子效率将是其在生物成像以及复杂的生物分析领域应用时所面临的挑战。随着硅罗丹明小分子荧光探针相关研究工作的快速发展，未来基于硅罗丹明近红外荧光探针一定能够为医学、药学、化学生物学等学科的发展发挥更大的作用。