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  • ISSN 1006-3080
  • CN 31-1691/TQ
纤维二糖酶在不同pH下的拉曼光谱分析
耿冰, 郭美锦, 张嗣良, 王永红, 储炬
分析了绿色木霉产的纤维二糖酶在pH 5.0和pH 2.0下的拉曼光谱图.实验结果表明:纤维二糖酶在pH 5.0时具有酶活功能,蛋白主链结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,侧链中酪氨酸和色氨酸均为"埋藏式";纤维二糖酶在pH 2.0时无酶活,酶蛋白主链结构主要为α-螺旋,而无规则卷曲发生较大变化,铡链中的酪氨酸和色氨酸均为"暴露式".根据光谱特征分析,该纤维二糖酶中可能不舍二硫键.
关键词: 纤维二糖酶, 激光拉曼光谱, 分子构象, 绿色木霉
CO2对脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的影响
王慧媛, 王泽建, 黄明志, 储炬, 庄英萍, 张嗣良
通过调整进气中空气和CO2的比例,研究了CO2的体积分数(φCO2)为0.03%,3.32%,8.86%和13.84%时对脱氮假单胞菌的生长和维生素B12合成代谢的影响。发酵过程的生理代谢分析结果表明:当进气中CO2体积分数增加到8.86%时,菌体的生长没有受到显著影响;而单位菌体糖消耗速率为29.95 mg/(g·h),仅为对照组的77%;产物的合成速率可达到1.75 mg/(L·h),比对照组1.02 mg/(L·h)的合成速率提高了71.6%。但CO2体积分数为13.84%时,菌体生长、底物利用以及维生素B12的合成都将受到抑制,因此在生产过程中控制CO2的体积分数非常关键。
关键词: 溶解CO2; 脱氮假单胞菌; 维生素B12
蚯蚓纤溶酶(EFE-3D)基因的合成及其在毕赤酵母中的表达
秦奕辉, 储炬, 黄文华, 庄英萍, 张嗣良
选择毕赤酵母偏爱密码子,分成32个长约48 bp且相互配对的寡核苷酸片段,合成蚯蚓纤溶酶基因EFE-3D。寡核苷酸片段经5′磷酸化后,通过错位拼接,PCR(聚合酶链式反应)一次性完成新基因的合成并且克隆至载体pP IC 9K中。最后利用电穿孔法将新基因克隆至毕赤酵母表达系统并进行诱导表达,用免疫印记法检测表达产物,最后利用纤维平板确定其表达产物的活性为3 500 mm2/mL,1 L发酵液相当于48 m g天然蚯蚓纤溶酶活性。
关键词: 毕赤酵母,蚯蚓纤溶酶,基因合成,密码子偏好性
不同拷贝数及间隔肽序列对毕赤酵母分泌表达EXA的影响
王晖, 钱江潮, 庄英萍, 储炬, 张嗣良
通过多拷贝串联表达,以及在分泌信号序列和目的蛋白N端之间插入几个氨基酸的间隔短肽,以提高exendin-4类似物串联体EXA在重组毕赤酵母中的分泌表达水平.实验结果表明:2~5个EXA串联插入均比单个EXA插入有利于提高表达水平,而4拷贝EXA串联体的表达产物较多滞留在胞内.在EXA的N端增加间隔肽可促进蛋白分泌,与不含间隔肽序列的4拷贝EXA串联表达载体相比,含有糖基化位点(NTTEEGEPK)和肠激酶识别位点(DDDDK)间隔肽的插入,使蛋白表达水平分别提高了4倍和9倍.
关键词: 间隔肽, exendin-4类似物, 多拷贝串联, 毕赤酵母, 分泌表达
头孢菌素C发酵过程代谢特性
冀志霞, 储炬, 庄英萍, 张嗣良, 罗家立, 白骅
考察了头孢菌素C的发酵过程特征,对发酵过程的重要生理参数DO、CER、OUR、RQ等进行了在线检测和相关分析,并分析了比生长速率和比产物生成速率的变化规律。在发酵过程中OUR、CER最高分别达到了90.2 m o l/(m3.h)和69.8 m o l/(m3.h),表明头孢菌素C发酵代谢强度很大,对氧的需求量也非常大。比产物生成速率在发酵60~100 h最高达到2.15 U/(h.g)(细胞干重)。同时分析了头孢菌素C发酵过程中甲硫氨酸代谢规律,表明维持培养基中一定浓度的甲硫氨酸对头孢菌素C的合成有促进作用。通过对三级发酵和四级发酵的比较,表明在现有的设备和工艺条件下,三级发酵生产头孢菌素C要优于四级发酵,同时通过控制发酵前期菌丝浓度可获得最大产素水平。
关键词: 头孢菌素C,发酵,代谢特性,甲硫氨酸
前体氨基酸对维生素B12发酵合成的影响
张一鸣, 王泽建, 张嗣良, 储炬, 黄明志, 庄英萍
谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸是维生素B12合成的重要前体。在脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrifican)发酵的产物合成期以补加的方式考察了这4种氨基酸对维生素B12合成的影响。在合成培养基的基础上,通过单因素添加试验分别考察了这些氨基酸对维生素B12合成的影响,发现谷氨酸、甘氨酸和苏氨酸影响显著;并进一步利用三因素三水平的正交试验设计考察了氨基酸混合添加对菌体生长和维生素B12合成的影响,结果表明谷氨酸是最主要的影响因素,并且发现同时添加多种氨基酸更有利。当添加量为谷氨酸0.45 g/L、苏氨酸0.20 g/L、甘氨酸0.15 g/L时,得到的菌体量和维生素B12产量分别比对照组提高了13.1%和46.0%。
关键词: 维生素B12; 谷氨酸; 苏氨酸; 甘氨酸; 甲硫氨酸
优化甲硫氨酸补料策略提高重组毕赤酵母G12-CBS合成S-腺苷甲硫氨酸
武晓乐, 秦秀林, 姚高峰, 储炬, 钱江潮
重组毕赤酵母G12CBS经代谢工程改造,可高效表达重组S腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶,并弱化了SAM转化途径的关键酶β胱硫醚合成酶,是一株优良的SAM高产菌。为了利用G12CBS高效合成SAM,需对前体(甲硫氨酸)的补料策略进行优化。首先在摇瓶中考察了不同甲硫氨酸(LMethionine,LMet)添加量对于G12CBS的影响,发现每24 h LMet补加量超过3 mg/mL时,会影响重组菌生长和SAM合成。在15 L发酵罐中优化LMet的补料速率,当外源补料速率为0.4 g/(L·h)时SAM产量最高,分别比补料速率为0.2 g/(L·h)和0.6 g/(L·h)时提高22.2%和31.8%,达到13.01 g/L,比出发菌最高产量提高54%。代谢物及酶活测定的结果表明,较低的LMet补料速率(0.2 g/(L·h))导致前体供应不足而影响SAM合成,过高的补料速率(0.6 g/(L·h))可能会抑制三羧酸循环,并且影响氮源的摄取和利用,从而导致菌体生长和产物合成受到抑制。
关键词: 毕赤酵母; S腺苷甲硫氨酸; 甲硫氨酸
生物搅拌反应器的CFD模拟及在肌苷发酵中的应用
赵卫宁, 潘家祯, 陈双喜, 张嗣良, 储炬, 庄英萍
通过改变搅拌桨叶间距,对50 L的气液搅拌生物反应器在指定转速、每升发酵液中每分钟通入空气1 L条件下的搅拌流场、剪切力、空气体积分率进行模拟,从流体力学角度对反应器进行了优化。将模拟优化结果用于实际肌苷发酵过程中,结果表明:计算流体力学(CFD)模拟优化后的搅拌桨位置能改善发酵罐内部的流场和气体分布,从而对菌体代谢和肌苷合成产生影响,使每升发酵液的产苷量提高了4.06 g。
关键词: 多桨叶系统,气液两相流,生物反应器,数值模拟
溶氧对谷氨酸棒杆菌发酵产谷氨酸代谢的影响
刘剑, 赵策, 储炬, 杭海峰, 郭美锦
分别控制0、5%、30% 3种溶氧水平进行谷氨酸分批发酵,考察了3种溶氧水平下谷氨酸棒杆菌发酵的代谢响应。结果表明,随着溶氧降低,发酵液中柠檬酸和α 酮戊二酸的含量降低,三羧酸(TCA)循环还原臂途径中的有机酸含量增加,丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸含量也有所增加,在溶氧为0时,乳酸和乙酸大量积累。通过分析不同溶氧水平下的相关酶活和胞内氧化还原状态,发现随着溶氧降低,谷氨酸脱氢酶酶活降低,乳酸脱氢酶酶活升高,胞内氧化还原电势升高,它们的共同作用使氧限制条件下发酵的代谢流流向TCA循环的还原臂途径和乳酸合成途径, 导致谷氨酸产量下降。
关键词: 谷氨酸发酵, 溶氧, 酶活, 氧化还原平衡, NADH/NAD+
Pichia pastoris发酵表达重组人复合α干扰素
郝玉有, 庄英萍, 王永红, 张嗣良, 储炬, 刘志敏
在Pichia pastoris表达系统中,研究了甘油补料周期、甲醇流加策略和诱导pH对cIFN表达的影响,优化后的发酵条件是:甘油补料周期为4 h,诱导pH为5.0,基于在线甲醇检测维持甲醇浓度不超过5 g/L。培养96 h后,最大细胞干重、cIFN的表达量和生物活性分别达到168 g/L、1.24 g/L和5.4×107U/mL。
关键词: 复合α干扰素,高表达,Pichia pastoris,甲醇流加
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