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  • ISSN 1006-3080
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人体肝脏靶向性新型AAV血清型载体的研发

    作者简介: 宁秦洁(1993-),女,山东烟台人,硕士生,主要研究方向:基因治疗。E-mail:ecust19930306@163.com;
    通讯作者: 肖啸, 979261307@qq.com

Development of a Novel AAV Serotype Vector for Human Targeted Liver

    Corresponding author: Xiao XIAO, 979261307@qq.com
  • 摘要: 为了增强腺相关病毒(AAV)载体的肝靶向性并研发新的病毒衣壳以逃避机体的免疫反应,进行了高效靶向肝细胞AAV载体的筛选。通过DNA shuffling技术选择8种AAV(AAV1~AAV9,AAV6~AAV9)cap基因序列进行cap基因的DNA改组,获得AAV衣壳蛋白(capsid)突变体库。将突变体基因库插入到含有AAV2 Rep基因和ITR序列的质粒中,最终获得的质粒(pIRC)具有全套AAV基因组序列(>107独立克隆,即细菌菌落)。经过共转染HEK293细胞,72 h后收集纯化病毒,获得AAV突变库。利用野生型5型腺病毒(wild type Ad5,wt Ad5)辅助感染人肝癌Hep G2细胞,并进行筛选后,最终在肝细胞中富集获得1种衣壳蛋白Cap突变体AAVXL12。通过将携带GFP基因的不同血清型重组AAV病毒感染Hep G2细胞,观察到不同程度的绿色荧光的表达,最终显示筛选到的血清型载体AAVXL12介导的GFP基因表达效果最好,荧光强度最强。因此本研究研发的新型对人体肝细胞高感染性的AAV载体,增强了基因转导的效率,有望为基因治疗提供新型的AAV治疗载体。
  • 图 1  通过DNA shuffling技术构建AAV衣壳蛋白突变体库

    Figure 1.  Construction of AAV capsid mutant library by DNA shuffling

    图 2  筛选获得AAVXL12 capsid突变体

    Figure 2.  Screening of AAVXL12 capsid mutant

    图 3  AAVXL12衣壳的序列组成

    Figure 3.  Composition of the AAVXL12 capsid sequence

    图 4  不同AAV血清型在鼠中的中和抗体滴度检测

    Figure 4.  Detection of neutralizing antibody titers in different AAV serotypes in mice

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    [14] 鲁文芳张明吴国章 . 熔融酯交换法合成氢化双酚A型聚碳酸酯. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20181209002
    [15] 张剑超杜文莉覃水 . 基于新型自适应采样算法的催化重整过程代理模型. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20180915001
    [16] 邓键邓诗峰尤欣桐周小艺 . 新型耐高温含硅芳炔树脂化学流变行为. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20181214001
    [17] 王雪黄睿沈永嘉 . 两种新型四硫代富瓦烯衍生物的合成与光电性能. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20180718001
    [18] 许浩杰高磊陆俊杰安琦 . 考虑波箔变形的波箔型气体箔片轴承润滑性能的数值研究. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190108001
    [19] 陈筱于海宁郑楠许传鹏姜广宇李永生 . 新型聚丙烯腈包覆硒化钴/碳复合材料的制备及其在锂离子电池中的应用. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190307001
    [20] 陈筱于海宁郑楠许传鹏姜广宇李永生 . 新型聚丙烯腈包覆硒化钴/碳复合材料的制备及其在锂离子电池中的应用. 华东理工大学学报(自然科学版), doi: 10.14135/j.cnki.1006-3080.20190307001
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-03-12
  • 网络出版日期:  2020-01-16

人体肝脏靶向性新型AAV血清型载体的研发

    作者简介:宁秦洁(1993-),女,山东烟台人,硕士生,主要研究方向:基因治疗。E-mail:ecust19930306@163.com
    通讯作者: 肖啸, 979261307@qq.com
  • 华东理工大学药学院神经分子药理学实验室,上海 200237

摘要: 为了增强腺相关病毒(AAV)载体的肝靶向性并研发新的病毒衣壳以逃避机体的免疫反应,进行了高效靶向肝细胞AAV载体的筛选。通过DNA shuffling技术选择8种AAV(AAV1~AAV9,AAV6~AAV9)cap基因序列进行cap基因的DNA改组,获得AAV衣壳蛋白(capsid)突变体库。将突变体基因库插入到含有AAV2 Rep基因和ITR序列的质粒中,最终获得的质粒(pIRC)具有全套AAV基因组序列(>107独立克隆,即细菌菌落)。经过共转染HEK293细胞,72 h后收集纯化病毒,获得AAV突变库。利用野生型5型腺病毒(wild type Ad5,wt Ad5)辅助感染人肝癌Hep G2细胞,并进行筛选后,最终在肝细胞中富集获得1种衣壳蛋白Cap突变体AAVXL12。通过将携带GFP基因的不同血清型重组AAV病毒感染Hep G2细胞,观察到不同程度的绿色荧光的表达,最终显示筛选到的血清型载体AAVXL12介导的GFP基因表达效果最好,荧光强度最强。因此本研究研发的新型对人体肝细胞高感染性的AAV载体,增强了基因转导的效率,有望为基因治疗提供新型的AAV治疗载体。

English Abstract

  • 基因治疗(Gene therapy)是通过基因水平改变来治疗疾病的方法,即通过基因载体(通常为改造过的病毒)导入一段有独立功能的基因进入体细胞,代替或纠正已经发生突变的基因进行独立表达,发挥其原本应该有的功能。经过近三十年的发展,基因治疗己经由最初用于单基因遗传病的治疗扩大到恶性肿瘤、感染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病等多种重大疾病的治疗。

    腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)是目前基因治疗领域中最常用的病毒载体之一,是细小病毒家族的成员,具有约4.7 kb的单链DNA基因组[1-2]。AAV基因治疗的安全性、有效性和持续性表达已经在绝大多数基因治疗的临床试验中得到了证实[3-11]。然而,研究表明,30%~40%的人群存在AAV中和抗体(Neutralizing antibody, Nab),这些预先存在的AAV中和抗体,即使在适度的滴度下,也能够在给予AAV后阻止其成功的转导。因此会导致功能基因表达量的降低,甚至产生免疫毒性,这类患者都不适用目前的治疗方案[10]。所有临床研究中的一致观察结果是针对AAV转导的肝细胞的免疫应答的风险取决于载体剂量[12-14]。这一观察结果突出了一个基本的治疗原则,即需要使用最低剂量,从而产生临床效益,同时尽量减少不良事件的风险。

    由于天然wt AAV感染,在大部分人群中发现Nab,而新型AAV血清型在人体内的中和抗体量较少,因此研发新型的AAV血清型在一定程度上可以克服中和抗体对基因治疗的影响。设计用于靶向递送基因的AAV衣壳的筛选(其通常依赖于序列分析和合理的肽插入)已经取得了一些成功,但是由于AAV载体介导的免疫反应的发生以及载体包装的报告基因的活性较低等因素的影响,这些新型AAV载体可能不是最理想的基因治疗载体[15-17]。基于此,我们首次通过人肝癌Hep G2细胞筛选新型AAV突变体改变衣壳向性的同时增强基因的传递,逃避AAV中和抗体。

    目前针对AAV衣壳的设计优化的主要方法为合理设计、定向进化、自然发现和计算机生物信息学方法。合理设计即利用衣壳生物学和宿主细胞靶标的预先存在的知识来设计组织特异性或细胞特异性细胞外标记物或免疫逃避的衣壳。虽然可以改善衣壳向性,但它也可能对衣壳的其他特征产生负面影响,例如其稳定性。计算机设计是一种新的衣壳发现方法,利用计算方法来预测自然界中未见的新衣壳设计,能够从现代衣壳重建祖先AAVs是计算机设计的一种形式。自然发现即从自然界中发现新型AAV衣壳,但由于40%~80%的AAV都有其相应的抗体,因此人源衣壳可能不是理想的基因治疗载体。包括DNA shuffling、error prone-PCR在内的定向进化技术能够产生具有特定生物学特性和有利特征的AAV遗传变体(例如,组织特异性靶向,免疫逃避和转基因表达)。再加上DNA shuffling技术是对cap基因改造能力最为有效的一种技术,它的主要优点是能够将所有的AAV血清型组合在一起产生许多独特的衣壳组合,其可以具有不同且有利的载体特性,避免单纯研究一种血清型而发生偏倚,不会在搜索序列空间方面受到限制[18]

    本研究通过DNA shuffling技术对8种AAV(AAV1~AAV4,AAV6~AAV9)cap基因序列进行DNA改组,利用wt Ad5对Hep G2细胞进行超感染,在Hep G2细胞内复制AAV颗粒,通过Hep G2细胞筛选新型AAV突变体,将新型AAV突变体与不同AAV血清型分别包装报告基因GFP,观察不同AAV血清型介导的绿色荧光的表达,同时对所筛选的新型突变体同其他血清型一起分别在小鼠中进行中和抗体的检测。

    • AAV1~AAV4,AAV6~AAV9共8种血清型腺相关病毒、含有ITR序列和氨苄抗性的pAAV-mcs、大肠杆菌TOP10、pAAV-GFP、pHelper、wt Ad5均为本实验室所有;HEK293细胞、Hep G2细胞均购自ATCC公司,Taq聚合酶、T4连接酶、DNase I酶、Benzonase酶均购自Takara公司;胶回收试剂盒、Plasmid Max Kit(25)均购自Omega公司;Dneasy Blood&Tissue Kit(250)购自QIAGEN公司;PEG 8000、碘克沙醇、蛋白酶K均购自Sigma-Aldrich公司;Zeta-Probe GT印迹膜购自Bio Rad公司;各种限制性核酸酶、Silver SNAP染色试剂盒II购自Thermo Fisher Scientific公司;胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、磷酸缓冲盐溶液(phsphatte buffered saline,PBS)、DMEM培养基(Dulbecco's modified eagle medium)、双抗(Penicillin-Streptomycin,Liquid)及胰蛋白酶(0.25%)均购自BI公司。

    • 高速离心机(CR21N型),购于日本日立公司;蛋白纯化仪(NGC QUEST10型),蛋白纯化收集器(Bio Frad型),购于美国Bio Rad(伯乐)公司;脱色摇床(翘板)(SK-R1807-E型),购于大龙兴创实验仪器(北京)有限公司;超净工作台(SW-CJ-2FD型),购于苏净安泰空气技术有限公司;全温落地摇床(ZWY-211C型),购于上海智城分析仪器制造有限公司;生化培养箱(SHP-250型),购于上海精宏实验设备有限公司;PCR仪(Veriti DX型),购于美国应用生物系统(ABI)公司;紫外透照台(TL-TM FL-26型),购于上海默威生物科技有限公司;台式离心机(FRESCO21型),购于美国Thermo Fisher Scientific公司;高压灭菌锅(80E型),购于山东新华医疗器械股份有限公司;实时荧光定量PCR仪(qTOWER3G touch型),购于德国耶拿分析仪器公司。

    • DNA shuffling是一种通过随机片段化和聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)重组对所选突变基因库进行体外同源重组的方法。用DNase I处理来自基因或指向同源基因的序列变体以产生随机DNA片段。用同源DNA作为模板和引物进行PCR扩增,将这些片段重新组装成与原始大小相同的基因,但具有可变功能[19]

    • 将HEK293细胞维持在含有10%FBS的DMEM培养基中。使用聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine, PEI)通过三质粒转染HEK293细胞产生重组AAV [20-21]。在转染后72 h从培养基中收获病毒颗粒。将细胞沉淀重悬于含有2 mmol/mL MgCl2,pH8的10 mmol/mL Tris中,冻融3次,并用100 U/mL Benzonase酶在37 ℃处理至少1 h。通过用含有500 mmol/mL氯化钠的8%聚乙二醇8000(Polyethylene glycol 8000, PEG 8000)沉淀浓缩病毒培养基,并将离心后的沉淀重悬于Tris-MgCl2中,将其与裂解液合并[22]。然后将合并的裂解液的盐离子浓度调节至500 mmol/mL NaCl,在37 ℃下孵育30 min,并在2 000 g下离心得到澄清的裂解液。然后将澄清的裂解液用碘克沙醇密度梯度(15%,25%,40%和60%)离心,将病毒浓缩并储存在磷酸盐缓冲盐水(0.001%(w/v)Pluronic F-68 + 0.2 mol/L NaCl)中[23]

    • 首先将2 μL样品与300 U的DNase I在25 mL限制酶缓冲液中于37 ℃温育1 h,然后补充1 mL 0.5 mol/L EDTA,pH8.0,在100 ℃温育10 min。随后,加入1 mL蛋白酶K混合物(4 mL 10%十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate, SDS),4 mL或5 U蛋白酶K,6 mL H2O)并将样品在50 ℃温育1 h。然后将蛋白酶K反应物用H2O稀释至100 mL,并用H2O将5 mL稀释的样品进一步稀释至300 mL,然后按照试剂盒说明的方法用30 kDa截留分子量的Ultra-0.5 mL离心装置处理。将回收的样品和线性化的标准品的系列稀释液在0.4 mol/L NaOH中1:20稀释,然后转移至Zeta-Probe GT印迹膜。交联后,用来自Hybrisol I中的载体质粒的EcoRI-PstI片段探测膜,并根据标准方法洗涤。在暴露于存储荧光屏之后,使用图像分析软件对图像进行定量。在本研究中,斑点杂交技术用于AAV基因治疗载体滴度测定[24]

    • SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE,SDS-PAGE)。根据制造商的说明,在5~12%凝胶上分离指示体积的样品。用Silver SNAP染色试剂盒II进行银染色。以检测病毒包装过程中空壳与实心的比例。

    • 中和抗体检测:基于细胞体外转导抑制的测定方法[25-27]。Nabs效价被定义为血清的最高稀释度,对于中和抗体的体内分析,将表达荧光素酶的AAV载体直接注射到6至8周龄的C57BL/6小鼠的肝脏中。两周的镜下观察转基因的表达[25],利用酶联免疫吸附测定技术(enzyme linked immune sorbent assay, ELISA)测定抗AAV抗体的总量[28]。用TBS-C(筛选测定)将对照和测试样品按照1:20稀释,或在含有1.08×1012 capsid/mL AAV(特异性/确证测定)并一式两份添加至平板[29]

    • 通过DNA shuffling技术构建了AAV衣壳蛋白突变体库如图1所示。本研究选择8种(AAV1-4,AAV6-9)用于cap基因的DNA改组,因为已显示AAV5 cap基因与其他AAV血清型相比具有最大的序列变异并可能降低体外重组的效率。从质粒文库中挑选随机克隆用于检查重组AAV cap基因的序列变异和生存力。每个病毒颗粒的cap基因型和表型都是一对一的对应关系,有利于连续筛选AAV文库。

      图  1  通过DNA shuffling技术构建AAV衣壳蛋白突变体库

      Figure 1.  Construction of AAV capsid mutant library by DNA shuffling

      为构建随机嵌合AAV衣壳基因文库,使用AAV血清型1、2、3、4、6、7、8和9作为PCR模板。通过引物1(5'-CCC-AAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA-3')和引物2(5'-ATAAGAAT-GCGGCCGC-AGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA-3')扩增衣壳基因。扩增后,使用DNase I处理获得cap基因混合物,处理后样品将得到许多DNA小片段,并以相等比例混合用于DNA改组[30]。将4 μg DNA模板用0.04 U的DNase I酶在15 ℃下短暂处理。通过琼脂糖凝胶电泳纯化大小为300~1 000 bp的DNA片段,变性,再退火并通过DNA聚合酶修复以重新组装随机衣壳基因。通过使用DNA聚合酶和引物1/2进行扩增。PCR程序是95 ℃,10 min;30个循环的95 ℃,30 s;55 ℃,30 s;72 ℃,1 min;72 ℃,3 min。然后用Hind III和Not I消化PCR产物,并连接到含有AAV2 Rep基因和反向末端重复序列的并且经过Hind III和Not I消化的质粒骨架中。通过将上述连接的DNA转化到DH10B大肠杆菌细胞中获得随机感染质粒文库。挑选随机克隆用于限制酶分析和293细胞中的复制和包装。最后将构建的新型病毒包装质粒同pHelper质粒共同转染HEK293细胞生产改组的感染性AAV文库。

    • 图2示出了筛选获得的AAVXL12 Capsid突变体。如图2(a),我们用腺病毒5(Ad5)对Hep G2细胞进行超感染,允许扩增内化的AAV文库克隆。回收扩增的AAV并进行两轮选择以富集AAV文库,并与Hep G2细胞结合、内化,在Hep G2细胞内复制AAV颗粒。从病毒中提取基因组DNA,并以此为模板,通过PCR扩增含有从选择的最后阶段回收的AAV capsid的DNA区域。扩增得到的cap基因再次插入到携带有AAV2 rep基因和ITR序列的质粒中,获得的质粒进行测序鉴定。如图2(b),将用于Ad5辅助细胞(pAd-Helper),AAV Rep和cap(pAAV-rep/cap,即新型突变体)和表达目基因的AAV载体(pAAV-GFP)三质粒共同转染HEK293细胞。在转染后的第3 d,收获重组AAV并进行纯化以获得纯化的病毒。通过几轮筛选后,最终富集获得一种衣壳蛋白Cap突变体AAVXL12。将携带GFP基因的不同血清型重组AAV病毒同所筛选到的新型AAVXL12分别以同一滴度感染Hep G2细胞,在感染之后的48小时,通过荧光成像检测不同血清型介导GFP基因表达。比例尺:50 μm。图2(c)示出了7种不同血清型重组AAV的荧光强度。从图2(c)能够明显看出AAVXL12的荧光强度最强,其次是AAV8、AAV9,而AAV1、AAV2、AAV6和AAV7的荧光强度显示最弱,基本无荧光。

      图  2  筛选获得AAVXL12 capsid突变体

      Figure 2.  Screening of AAVXL12 capsid mutant

    • AAVXL12衣壳的序列组成如图3所示,用Align X将AAVXL12的测序结果与AAV1-4、AAV6-9 cap序列进行对比,发现AAVXL12 cap序列由AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8 5种AAV的cap序列组成,全长2103 bp。

      图  3  AAVXL12衣壳的序列组成

      Figure 3.  Composition of the AAVXL12 capsid sequence

    • 将筛选出来的AAVXL12与AAV8用同一病毒量分别感染健康小鼠的肝脏来进行中和抗体的检测,结果如图4所示。从图4中看出,我们所筛选到的新型AAVXL12载体的Nab阳性率在30%左右(小于1:8稀释)。而AAV8阳性率在90%左右。因此,AAVXL12较低的中和抗体阳性率使得它更加适用于基因治疗的研究。

      图  4  不同AAV血清型在鼠中的中和抗体滴度检测

      Figure 4.  Detection of neutralizing antibody titers in different AAV serotypes in mice

    • 迄今为止,已从各种物种中分离出超过100种AAV基因型,包括山羊、牛、非人灵长类动物和人类[31-32]。目前适用于基因治疗的AAV血清型为1-9型,并且各种血清型对不同的组织器官具有不同的感染能力[32]。虽然有个别AAV血清型对小鼠肝脏组织感染能力较强(如AAV8),但普遍特异性较差,同时也会对其他组织器官存在较强的感染能力。在应用于基因治疗研究中时,往往会造成副作用。该研究的目的是在静脉注射时重新靶向并优化AAV载体对于肝脏的组织趋向性。为了设计具有组合特性的载体,我们通过DNA改组产生AAV衣壳基因文库并进行筛选。我们研究的主要优点是避免血清型偏倚的限制。研究结果表明:我们确实通过人肝癌Hep G2细胞筛选到了肝脏高亲和力的新型突变体AAVXL12,增强了对肝细胞的趋向性的同时减少了中和抗体的产生。新型血清型AAVXL12最大的优势是对肝脏的高亲和力,从而大大增强肝细胞基因转导效率,将其用于基因治疗时,只需要很少的用量就能达到理想的治疗效果。因此将基因载体的用量及可能的细胞免疫应答最小化。这一创新载体大大增加了基因治疗用药人群,降低了毒副作用。但是新型血清型AAVXL12对其他组织器官的感染力我们还需要进一步地研究,之后我们将通过携带荧光蛋白的AAVXL12载体静脉注射到小鼠中,并通过测定肝脏和几个对照器官中的荧光素酶活性的方法来检测AAVXL12对其他组织器官的感染效果。

(4)  参考文献 (32) 相关文章 (20)

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